Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Книга Лаборат. диагностика инфекц. болезней.doc
Скачиваний:
266
Добавлен:
20.03.2016
Размер:
12.07 Mб
Скачать

Индикация и идентификация вируса

Для определения вируса в различных материалах используют методы, позволяющие выявлять инфекционный вирус или вирусные АГ. Являясь типичным ретровирусом, ВЛКРС находится у инфицированных животных в форме провирусной ДНК, которую можно вы­явить в лимфоцитах крови с помощью ПЦР или методами гибридизации нуклеиновых кислот. При культивировании инфицированных клеток вирус можно выявить с помощью электроннoгo микроскопа или по образованию синцития в соответствующих индикаторных культурах.

Электронно-микроскопический метод. Позволяет выявлять вирусные частицы в культурах лейкоцитов крови животных, инфицированных ВЛКРС, и в монослойных культурах клеток, сокультивированных с инфицированными лимфоцитами. По некото­рым данным, лейкоцитарные культуры (лейкоциты крови больных коров) через 48-72 ч представлены разнообразными клетками, среди которых находили лимфоциты и лимфобласты, продуцирующие вирусные частицы типа С. Зрелые вирионы имели ультраструктуру, типичную для онковируса типа С. Вирусные частицы находили, в основном, в межклеточных пространствах и на внешней мембране лимфоидных клеток. Методом ЭМ у больных лейкозом животных обнаруживают в лимфоцитах ядерные "карманы" в виде неправильного кольца и петли. Как правило, они обладают связью с оболочкой ядра и содержат цитоплазматическое вещество клетки. Иногда центральная часть их заполнена электронноплотными гранулами диаметром 4 нм, расположенными группами и напоминающими гранулы гликогена. Ядерные "карманы" отсутствуют в дифференцированных гранулоцитах, моноцитах и плазматических клетках; в одном лимфоците их обнаруживают 1-5 и более.

Тест синцитиеобразования. ТСО применяется для выявления инфекционного вируса в различных материалах и основан на способности ВЛКРС образовывать синцитии в некото­рых нетрансформированных монослойных культурах клеток и в трансформированных пере­виваемых культурах клеток СС81. Метод предложен для титрования ВЛКРС с использова­нием кошачьей линии клеток S+L. Показано, что заражение клеток вирусом лейкемии КРС приводит к образованию крупных многоядерных синцитиев, которые выявляются при ок­рашивании монослоя. Метод можно использовать для титрования вируса, так как имеется прямо пропорциональная зависимость между уменьшением количества синцитиев и разве­дением вирусной суспензии. Метод является воспроизводимым, специфическим и чувстви­тельным. Рекомендуют микромодификацию метода количественной титрации инфекционно­го ВЛКРС, основанную на определении количества синцитиев в культуре эмбриональных клеток теленка, культивированной с лимфоцитами, зараженными вирусами лейкемии КРС, или в присутствии вируса. Отмечена линейная зависимость между числом инокулированных в культуре клеток зараженных вирусом лейкоцитов и количеством индуцированных синци­тиев. При сравнении чувствительности макро- и микрометода титрации число синцитиев в микрокультуре статистически не отличалось от числа синцитиев, индуцированных в макро­культуре. Метод сокультивирования используется для выявления инфекционного ВЛКРС. Суть его состоит в сокультивировании лимфоцитов крови и чувствительных клеток моно-слойной культуры с последующим выявлением АГ ВЛКРС с помощью ТСО, РИД или ИФА.

РДП (РИД). Это относительно чувствительный тест для выявления гликопротеина ВЛКРС. Позволяет выявлять гликопротеин вируса в концентрации 0,4 мкг/мл.

Биопроба. Инфицированных животных можно выявлять путем постановки биопробы на овцах. С этой целью овцам обычно внутрибрюшинно вводят цельную кровь испытуемого животного. При наличии в пробе крови вируса у овцы развивается инфекция, сопровож­дающаяся образованием вирусспецифических AT. AT у зараженных овец выявляют в РДП с гликопротеинным АГ через 3-6 нед.

Реакция бласттрансформации. Хронический лимфоидный лейкоз КРС характеризует­ся слабой реакцией бласттрансформации (РБТЛ). Поэтому у животных, подозрительных по заболеванию лейкозом по показателям лейкоцитов крови, проводят РБТЛ в культуре лим­фоцитов крови. Показатель РБТЛ выражает процент трансформировавшихся лимфоцитов (переходные клетки, бласты, митозы) и определяется после подсчета не менее 1000 клеток культуры. У клинически здоровых и с нормальной гемограммой коров, по данным боль­шинства исследователей, он составляет в среднем 60% (40-90%); у больных лимфолейкозом РБТЛ значительно снижена уже в субклинической стадии. При повышенном содержании в крови общего количества лейкоцитов исследуют животных в РБТЛ. Диагноз на лимфолейкоз считают подтвержденным при показателе РБТЛ не выше 35%. Если он выше, то поста­новку реакции повторяют с интервалом 3 мес у тех животных, у которых нарастают гемато­логические изменения.

Гистологические исследования. Срезы готовят после парафиновой проводки и окрашивают гематоксилинэозином. При лимфоидном лейкозе наблюдают в селезенке и лимфоузлах стирание рисунка за счет диффузной инфильтрации клеток лимфоидного ряда, среди которых, в основном выявляют зрелые лимфоциты, в меньшем количе­стве обнаруживают пролимфоциты, лимфобласты. В костном мозге строма сохранена, вы­является значительное истончение и рассасывание балок, скопления лимфоцитов могут рас­полагаться в виде очагов или диффузно, заполняя все костно-мозговые пространства (лимфоидная метаплазия); в почках, печени, сердце, сычуге и других органах обычно выявляют скопления лимфоцитов в просветах капилляров и инфильтрации лимфоидными клетками интерстициальной ткани.

При недифференцированном и слабо дифференцированном лейкозе (гемоцитобластоз) в костном мозге, селезенке, лимфоузлах и других органах наблюдают очаговые и диффузныe пролифераты, клеточный состав которых представлен недифференцированными или слабо дифференцированными клетками типа гемоцитобластов (родоначальная клетка). При миелоидном лейкозе (встречается редко) обнаруживают в селезенке незрелые элементы гранулоцитарного ряда, мегакариоциты, клетки типа гемоцитобластов, фрагментацию и распад аргирофильных волокон, в костном мозге - скопления зрелых и незрелых клеток гранулоцитарного ряда; в лимфоузлах, печени, почках, легких и других органах - очаговые диффузные разрастания миелоидных элементов; при лимфосаркоме (слабо дифференцированная лимфобластическая, лимфоцитарная, гистоцитарная) в лимфоузлах, органах пищеварения, воспроизведения, сердечной, скелетных мышцах, других органах и тканях отмечают разрастание опухолей из недифференцированных или слабо дифференцированных клеток лимфоидного типа. Селезенка и костный мозг не изменены.

При лимфогранулематозе выявляют гиперплазию лимфоидных клеток или полиморфноклеточную пролиферацию, склеротические изменения и некрозы в лимфоузлах, селезенке, печени и других органах; среди полиморфных клеток выявляют многоядерные гигантские клетки типа Березовского - Штернберга, плазматические клетки, эозинофилы и нейтрофилы различной зрелости, а также фибробласты. Для установления причин несоответствия прижизненных и посмертных диагнозов на лейкоз патологический процесс при этой болезни разделен на 5 стадий: скрытая (инкубационная), предлейкозное состояние, начальная, развернутая и конечная. Диагноз по картине крови при гистологическом исследовании не подтверждался лишь на ранних стадиях развития процесса, что не отрицало возможности нарушения лимфопоэза, при котором отмечалась усиленная пролиферация лимфоцитов и наводнение ими периферической крови. Отсутствие малигнизированных, лейкемических лимфоцитов на ранних стадиях болезни подтверждалось не только цитоморфологическими, но и физико-химическими методами исследований. Изучение тонких морфологических особенностей клеточных элементов крови и кроветорных органов позволило разделить все клетки на 4 группы, из которых патогномоничное значение имеют клетки 3-й группы – молодые и малодифференцированные клетки гемопоэза; и клетки 4-ой группы - атипичные, малигнизированные клетки, отражающие опухолевый процесс.

Комплексные методы исследования позволили дифференцировать различные формы гемобластов у КРС. К гемобластозам с системным поражением органов кроветворения отнесены лейкозы: лимфоидный, недифференцированный (гемоцитобластоз), гистиоцитарный (системный ретикулез) и миелоидный. К опухолевым гемобластозам (гематосаркомы) авторы относят: лимфосаркому, гистиоцитарную саркому или лимфогранулематоз.

Гематологический метод. Основан на обнаружении в периферической крови повышенного количества лейкоцитов, в основном лимфоидного ряда, и слабодифференцированных клеток (родоначальных, пролимфоцитов, лимфобластов). Количество лейкоцитов подсчитывают с помощью электронного счетчика частиц или в камере Горяева и выводят лейкоцитарную формулу. Животных, подозрительных по заболеванию лейкозом, подтвергают дополнительным гематологическим исследованиям с интервалом 2-3 мес до получения 2-х одинаковых результатов, по которым их признают здоровыми или больными лейкозом.

Следует иметь в виду, что некоторые острые и хронические болезни КРС (перикардиты, улиты, гепатохолангиты, цирроз печени, туберкулез, бруцеллез и др.) могут сопровождаться лейкоцитозом. При этом в отличие от лейкоза увеличение количества лейкоцитов происходит, в основном, за счет нейтрофилов, эозинофилов или моноцитов. Эти изменения крови имеют временный характер, их дифференцируют от лейкоза повторными гематологическими исследованиями.

Число лейкоцитов и лимфоцитов в 1 мм3 крови здорового,

подозрительного по заболеванию и больного лейкозом КРС

Возраст животных (лет)

Число лейкоци­тов у здоровых

Абсолютное число лимфо­цитов у подозрительных

Абсолютное число лимфоцитов у больных

От 2 до 4

До 11000

От 8000 до 10000

Свыше 10000

От 4 до 6

До 10000

От 6500 до 9000

Свыше 9000

Старше 6

До 9000

От 5500 до 8000

Свыше 8000

Разработана методика выделения мононуклеарных клеток из периферической крови инфицированного КРС и их культивирования для репродукции инфекционного вируса лейкоза. Метод позволяет получать максимальный сбор инфицированных вирусом лейкоза лимфоцитов. Из 10 мл цельной крови получают пример­но 107 мононуклеарных клеток. Чтобы максимизировать продукцию вирионов и вирусных АГ, к культуре лимфоцитов добавляют Кон-А в конечной концентрации 5 мг/мл.

Конкурентный радиоиммуноанализ (РИА). Наиболее чувствительный метод выявле­ния АГ в культурах лимфоцитов крови инфицированных животных. Метод заключается в том, что экстракт, приготовленный из 48-ч культуры лимфоцитов кро­ви, исследуется на присутствие АГ р24 путем определения его способности предотвращать связывание меченого изотопом р24 со специфическими AT. Для диагностики инфекции ВЛКРС у телят младше 6-мес возраста, которым выпаивали молозиво инфицированных ма­терей, а также у взрослых животных, иммунизированных убитым вирусом или вирусными АГ, необходимо использовать методы, основанные на прямом выявлении инфекционного вируса или вирусных АГ в культурах лимфоцитов крови исследуемых животных.

ПЦР. Дает возможность обнаруживать провирусную ДНК через 2 нед после заражения животных. Для амплификации в ПЦР использовали пары праймеров, соответствующих определенным участкам генов gog 24, env-gp5 или pol вируса лейкоза. Метод позволяет идентифицировать одну копию генома вируса лейкоза на 100000 клеток крови. Сконцентрированные также праймеры для амплификации специфических для вируса лейко­за КРС последовательностей генов pol и рХ. С помощью этого набора праймеров удавалось амплифицировать и выявлять 10 копий ДНК вируса в присутствии в образце 1 мкг хромо­сомной ДНК. Доказана возможность использования нерадиоактивных зондов для выяв­ления вируса лейкоза КРС в лимфоцитах периферической крови и клетках лимфосаркомы. Фрагменты провирусной ДНК метят биотипом. Разработан метод ПЦР с последующей нерадиоактивной блот-гибридизацией для тестирования провируса лейкоза КРС в исследуе­мом материале.