Бактериологическое исследование

Прижизненно материал берут на острой стадии течения болезни у живот­ных с повышенной температурой, не подвергавшихся обработке антибио­тиками. Отбирают пробы крови, стерильными ватными тампонами — носо­вую слизь. В летальных случаях материал берут по возможности сразу после смерти животного: пробы трахеальнои слизи, участки пораженных Легких, перикардиальную и плевральную жидкость, сегменты тонкого ки­шечника с изменениями, субменингиальные мазки, сегменты мозга, цереб­роспинальную жидкость из латерального желудочка, фибринозный экссу­дат из пораженных суставов, лимфоузлы, регионарные урогенитальным органам. Материал доставляют в лабораторию в замороженном виде, луч­ше — при температуре ниже -60° С.

Микроскопическое исследование исходного материала

Из исследуемого материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают по Граму и на капсулы. В положительных случаях обнаруживают грамотрицательные палочковидные, вплоть до кокковидных, бактерии с капсулой.

Выделение и идентификация возбудителя

Культивирование. Н. somnus требует для своего роста повышенного содержания С0₂ (5-10%), в обычной атмосфере не растет. Температурный оптимум 37-38° С, рН пита­тельных сред 7,8. Зависимости роста от Х- и V-ростовых факторов нет, хотя в первых пассажах возбудитель может проявлять феномен роста около штриха S.aureus на сывороточном (10%), но не «шоколадном» или кровяном агарах. Свежевыделенные штаммы не растут на общепринятых питательных средах, сывороточном, гемоглобиновом агаре, ингредиенты которого стерилизовали автоклавированием, плохо растут на «шоколадном» агаре. Оптимальной пита­тельной средой для первичной изоляции возбудителя является агар с цитрированной кровью (5-10%) крупного рогатого скота. Кровь других животных стимулирует рост Н. somnus хуже.

При незначительном содержании клеток возбудителя в исследуемом ма­териале (данные микроскопии) целесообразно параллельно делать высевы на среду обогащения — сердечно-мозговой бульон с добавками дрожжево­го экстракта, крови крупного рогатого скота или заражать в желточный мешок 7-дневные куриные эмбрионы. В случае отсутствия роста на кровя­ном агаре через 24-48 часов делают высевы со сред обогащения на кровя­ной агар.

На питательные среды целесообразно делать посев кусочками органов, в жидкие среды помещают фрагменты исследуемых тканей. На кровяной агар делают посевы в две чашки Петри, одну из которых культивируют в атмос­фере СО₂ другую — в обычной атмосфере (контроль на присутствие других видов бактерий). Посевы инкубируют в течение 48-72 часов.

На кровяном агаре через 48 часов возбудитель формирует нежные, про­зрачные, круглые, выпуклые, с гладкой поверхностью колонии диаметром 0,5-1 мм, достигающие через 72 часа 2 мм. Часть колоний (около 50%) может иметь узкую зону β-гемолиза. При длительном культивировании у колоний образуются конусовидный центр и плоская периферия, на поздних стадиях роста может появляться желтоватый пигмент. В сердечно-мозго­вом бульоне рост возбудителя проявляется незначительным помутнением среды.

Морфология клеток возбудителя в культуре. В первичных культурах возбудитель имеет склонность к полиморфизму: коккобактерии, палочки, нити. В субкультурах Н. somnus чаще представ­лен грамотрицательными палочковидными или нитевидными формами, иног­да обнаруживаются структуры неправильной формы. При микроскопичес­ком изучении колоний в агаровом блоке, окрашенном по Клинбергер-Гимза, находят длинные извилистые нити с овоидными утолщениями, а также хорошо окрашенными полярными зернами и цепи из бактерий. Клетки име­ют капсулу, жгутиков нет.

При просмотре первичных посевов обращают внимание на наличие ко­лоний с грамбтрицательными коккобактериями и палочками в чашке Пет­ри, инкубированной в аэробных условиях (это могут быть пастереллы и актинобациллы). Для исследования берут колонии бактерий, растущих толь­ко в присутствии СО₂.

Идентификация возбудителя по ферментативным свойствам. Идентификация Н. somnus, как вида с неясным систематическим поло­жением, проводится непосредственно на видовом уровне.

Для изучения ферментативных свойств отбирают колонии бактерий, ко­торые не способны расти на обычном агаре и бульоне без ростовых доба­вок, а также в отсутствие СО₂ и имеют типичные для Н. somnus культуральные, морфологические и тинкториальные признаки.

У выделенных культур исследуют каталазиую, оксидазную активность, способность к редукции нитратов, образованию индола, уреазы, лизиндекарбоксилазы, аргининдигидролазы, потребность в V- и Х-ростовых факто­рах (посев на сывороточный агар с дисками, пропита нными растворами NAD и гемина), расщепление углеводов с образованием кислоты. Ферментативные характеристики H.somnus представлены в таблице 81.

Таблица 81 - Ферментативные свойства и ростовые потребности Н. somnus

Признаки	Результат
Оксид аза Редукция нитратов Индол Каталаза Уреаза Орнитиндекарбоксилаза Аргениндигидролаза Потребность в NAD Потребность в Х-факторе Утилизация нитратов Образование кислоты из: фруктозы, D-глюкозы, мальтозы,D-маннита,D-маннозы,D-сорбита, трегалозы,D-ксилозы Отсутствие образования кислот из: адонита, а-арабинозы, целлобиозы глицерина, инулина, лактозы, мелибиозы, раффинозы, салицина, сахарозы	+ + + - - - - - - - + -

Серологическая идентификация возбудителя

При наличии гипериммунных сывороток может быть проведена сероло­гическая идентификация возбудителя в РА или иммуноферментным методом. Использование РА осложняется склонностью культур к спонтанной агглютинации. С целью получения антигена культуру выращивают в PPLO-бульоне с фильтрованным дрожжевым экстрактом на шуттель-аппарате в течение 24 часов. Клетки осаждают центрифугированием, отмывают в ве-роналовом буфере (рН 8,0), осадок ресуспензируют в вероналовом буфере (1/30 исходного объема). Суспензию прогревают при 60° С в течение 45 минут. Прогретые культуры не дают самоагглютинации. Пробирочную РА ставят общепринятым способом с разведением сыворотки до титра. Про­бирки выдерживают при 37-38° С в течение 48 часов и учитывают резуль­тат.

Серологическая диагностика. Широко распространенное носительство возбудителя и частое инаппарантное течение инфекции приводят к тому, что приблизительно в 50% обследо ванных стад в РСК реагируют положительно от 10 до 100% животных. В то же время переболевание ведет лишь к кратковременному и небольшому по­вышению уровня гуморальных антител, что делает пока нецелесообразным практическое использование серодиагностики болезни.

Питательные среды

Кровяной агар. В качестве основы используют агар Хоттингера (рН 7,8). К расплав­ленному и остуженному до 45° агару добавляют 5-10% стерильной свежей цитрированной крови крупного рогатого скота, компоненты перемешива­ют, среду разливают по чашкам Петри.

Сердечно-мозговой бульон («Дифко»). В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 12,5 г сухого мозгового отвара, 10,0 г протеозопептона, 2,0 г декстрозы, 5,0 г натрия хлорида, 2,5 г двунатриевого фосфата, устанавливают рН 7,8, стерилизуют при 121° С 15 минут. Стерильную среду обогащают добавлением 5% стерильного дрож­жевого экстракта, или 5-10% стерильной крови крупного рогатого скота, или оба компонента.

Лабораторная диагностика контагиозного метрита лошадей

Контагиозный метрит лошадей — инфекционная болезнь, характеризующа­яся развитием эндометрита, цервицита. Обычно возникает после случки ко­былы с жеребцом-бактерионосителем. На 6-8-й неделе после случки может произойти аборт или резорбция плода. У жеребцов инфекция клинически не проявляется. Возбудитель — бактерия Teylorella equigenitalis (прежнее наи­менование — Haemophilus equigenitalis), относящаяся к недавно сформиро­ванному роду Teylorella, в котором является единственным видом.

Бактериологическое исследование

Наружные половые органы обмывают антисептическим раствором (КМnО₄ 1:1000), осушают салфетками. Стерильными тампонами берут пробы слизи из препуциальной ямки головки клитора (клиторные про­бы). Цервикальные пробы (цервикальная слизь) берут при помощи сте­рильных полистироловых осеменительных пипеток и влагалищного зер­кала. У жеребцов объектом исследования являются пробы, взятые ув­лажненными тампонами с головки пениса, препуция, уретрального ка­пала.

Возбудитель отличается слабой устойчивостью. Материал доставляют В лабораторию не позднее 3-4 часов после взятия. Лучше для транспорти­ровки использовать специальную среду Timoney P.Y. и соавт. (1982). Если материал до посева выдерживают в закисленной среде (рН 4), то возбуди­тель погибает в течение 3-5 минут.

Микроскопическое исследование исходного материала

Этот метод исследования дает информацию только при клинически вы­раженной инфекции в случае исследования воспалительного экссудата из матки. Мазки окрашивают по Граму. Возбудитель в окрашенных препаратах грамотрицательный, имеет форму коротких палочковидных, вплоть до кокковидпых клеток размером 0,7 х 0,7-5,0 мкм.

Выделение и идентификация культуры возбудителя

Культивирование. Возбудитель — микроаэрофил (10% СО₂), температурный оптимум 36-37° С (диапазон 30-42° С), рН 7,2-7,6; на обычных средах не растет, на кровяном и сывороточном агаре не растет или рост очень слабый; хорошо культивируется на «шоколадном» агаре, но зависимости от присутствия V-или Х-ростового факторов не проявляет. В условиях обычной атмосферы или в анаэробных условиях возбудитель растет плохо. Материал дробно высевают на «шоколадный» агар в чашках Петри. Используют для изготов­ления среды кровь лошади. Поскольку материал содержит сопутствующую микрофлору, целесообразно проводить посев на селективные среды со стреп­томицином, амфотерицином и кристаллвиолетом. Возможно выделение стрептомициночувствительных штаммов, поэтому рекомендуется посев произво­дить одновременно на две селективные среды: «шоколадный» агар со стрептомицином и «шоколадный» агар с амфотерицином и крисгаллииолетом (Тей­лор К. и соавт., 1978).

Посевы инкубируют при 37° С в атмосфере 10% СО₂ Макроскопически видимый рост обычно появляется через 48 часов, но иногда позднее, поэтому в отрицательных случаях посевы рекомендуется выдерживать до 7 суток.

На «шоколадном» агаре через 2-4 суток инкубирования в оптималь­ных условиях формируются круглые, выпуклые, с блестящей поверхнос­тью и конусовидным центром полупрозрачные колонии, первоначально диаметром 0,25-1 мм, позднее — до 1,5-3 мм, цвет колоний от светло-кремового до коричневого.

На кровяном агаре колонии имеют диаметр 0,3-1 мм, цвет от светло-белого до коричневого, заметна зона ά-гемолиза, которая отчетливо видна только на 5-7-й день культивирования. Гемолитическая активность в боль­шей степени проявляется при использовании эритроцитов лошади и в мень­шей — овцы.

Характерна консистенция колоний на плотных питательных средах. При надавливании бактериологической петлей колонии скользят по поверхнос­ти среды. После помещения бактериальной массы старых культур в воду образуется гель, что заметно при изготовлении мазков для окраски по Граму.

В жидких питательных средах (сердечно-мозговой бульон) на 3-4-е сутки инкубирования рост возбудителя проявляется легким помутнением среды.

Морфология клеток возбудителя в культуре. В мазках из культур, окрашенных по Граму, возбудитель представляет собой грамотрицательные палочковидные клетки (0,7 х 0,7-1,8 мкм), иног­да почти сферические. Могут быть выявлены нитевидные формы, капсулы и жгутиков нет.

Идентификация возбудителя по ферментативным свойствам. Вид T.equigenitalis является на сегодня единственным представителем рода, но при бактериологическом исследовании могут быть выделены сход­ные виды бактерий других родов, от которых возбудитель необходимо диф­ференцировать на первом этапе исследования: Wolinella recta, Bacteroides ureolyticus и Bacteroides gracilis. Перечисленные виды обитают в организме человека и в исследуемом материале могут присутствовать как контаминанты. С указанной целью определяют у выделенных культур подвижность, на­личие уреазы, оксидазы, способность к восстановлению нитрата и нитрита. Для дальнейшего изучения отбирают бактерии, не имеющие жгутиков, не образующие уреазу, обладающие оксидазной активностью, не редуцирую­щие нитраты и нитриты.

У культур контролируют отсутствие способности к росту в обычной атмосфере, наличие фосфатазы. Фосфатазную активность проверяют следу­ющим образом: в 0,5 мл трисбуфера (рН 8,0) суспензируют несколько по­дозрительных колоний, добавляют 0,5 мл раствора р-нитрофенилфосфата (1 мг/мл), смесь выдерживают при 37° С в течение 2 часов. Положительный результат — желтое окрашивание. T.equigenitalis вырабатывает фосфатазу. В случае необходимости проверяют другие ферментативные свойства и рос­товые потребности. Для Т.equigenitalis свойственно отсутствие потребности В V-и Х-ростовых факторах, хотя последний несколько стимулирует рост, отсутствие синтеза лецитиназы, утилизации цит­ратов, продукции индола, сероводорода, Р-галактозидазы, желатиназы, ар­гинин и лизиндекарбоксилазы, оксидации глюконата, образования кислоты из сахарозы, глюкозы, мальтозы, арабинозы, рибозы, ксилозы, эскулина, дек­строзы, дульцита, галактозы, маннозы, маннита, рамиозы, сорбита, целлобиозы, лактозы, раффинозы.

Сахаролитические свойства испытывают посевом на среды Гисса с 10% сыво­ротки крови, 1% испытуемого углевода, 0,002% бромкрезола пурпурового.

Серологическая идентификация возбудителя. При наличии гипериммунных сывороток возможна идентификация воз­будителя в реакции агглютинации или коагглютинации. РА на стекле целе­сообразно использовать на стадии отбора подозрительных колоний, при этом допускается слабая спонтанная агглютинация бактерий в контроле с физиологическим раствором. Более специфической и чувствительной счи­тается реакция коагглютинации. Антительный диагностикум готовят обыч­ным способом, используя стафилококк, содержащий А-протеин. Для отчетливой агглютинации необходимо, чтобы исследуемая бактериальная суспензия содержала как минимум 6x10^s клеток возбудите­ля. Одновременно ставят контроль на спонтанную агглютинацию. Учет результатов проводят через 5 минут.

Идентификация T.equigenitalis в ПЦР. Разработана тест-система для выявления возбудителя в исследуемом ма­териале в реакции цепной полимеризации. Учитывая сложность культиви­рования возбудителя и его выделения, особенно в случае исследования бак­терионосителей, применение ПЦР оправдано при оценке статуса живот­ных, предназначенных на экспорт.

Биопроба. Лабораторные животные к T.equigenitalis не чувствительны. В случае от­рицательного результата бактериологического исследования можно ис­пользовать биопробу на кобылах. Для ее постановки берут смегму у же­ребцов из уретральной ямки, уретры, препуция, пениса, у кобылы из клиторного синуса и ямки. Смегму разбавляют в 30 мл дистиллированной воды и ин окулируют при помощи осеменительной пипетки в матку кобы­ле. Если смегма содержит возбудитель, то через три дня его можно выде­лить из цервикальной или маточной слизи. Одновременно до заражения и после заражения (7-14-е сутки) у кобылы исследуют сыворотку крови на наличие антител в РСК и РА.

Серологическая диагностика

Болезнь сопровождается синтезом гуморальных и секреторных антител. В основном используют методы, основанные на обнаружении гуморальных антител.

В РСК и пробирочной РА антитела удается выявить на 7-14-е сутки после заражения, и они достигают максимума к 15-20-е суткам (РСК 1:16 1:512; РА 1:80-1:640), затем их уровень довольно быстро снижается, осо­бенно в РСК. Поэтому позитивные показания этих серологических реак­ций обычно совпадают с клиническими признаками болезни и могут помочь в уточнении этиологии воспаления гениталий. Лошадей-бактерионосите­лей при помощи РСК и РА, как правило, выявить не удается. В отдаленные сроки целесообразнее использовать более чувствительные серологические реакции (иммуноферментный метод, РНГА).

В России в соответствии с «Методическими указаниями по лаборатор­ной диагностике контагиозного метрита лошадей» (1984) для серологичес­кой диагностики болезни рекомендована пробирочная РА. В качестве ан­тигена применяют инактивированную формалином (0,25%) взвесь бакте­рий концентрацией 10 млрд.м.к. в 1 мл по оптическому стандарту мутнос­ти. РА ставят в объеме 1 мл, на 3%-ном растворе натрия хлорида (рН 7,2-7,4) в разведениях 1:20 и 1:40. Учет результатов проводят через 20-24 часа. Как положительный результат оценивают реакцию интенсивностью на три креста и более в разведении 1:40, сомнительный — на два креста в разведении 1:20 или на один-два креста в разведении 1:40.

При постановке РСК антиген готовят из 72-часовой культуры, выращен­ной на «шоколадном» агаре. Бактериальную массу смывают трис-буфером (рН 7,4), трижды отмывают центрифугированием, ресупендируют в буферном растворе и консервируют мертиолатом (1:10 000). Рабочее разведение антиге­на определяют в опыте титрации обычным способом. Реакцию ставят в объеме 1 мл. Исследуемую сыворотку крови инактивируют при 56° С в течение 30 минут. Эритроциты барана берут в концентрации 1%.

Первую фазу РСК проводят при 4-5° С в течение 17 часов. После до­бавления индикаторной системы компоненты выдерживают в водяной бане при 37° С в течение 1 часа.