Питательные среды

Рецепты базовых питательных сред для культивирования B.nodosus изло­жены в других разделах (Brucella-агар, агар Schadler и др.).

Стимулирующая ростовая добавка для выращивания B.nodosus

а) Раствор гемина: 50 мг гемина растворяют в 1 мл I N NaOH, добавля­ ют 100 мл воды, автоклавируют при 121° С 15 минут.

б) Раствор витамина К (менадион): 100 мг менадиона растворяют в 20 мл 95%-ного этанола и стерилизуют фильтрацией.

в) смешивают 1 мл менадиона и 100 мл гемина. К 100 мл питательной среды добавляют 1 мл смеси.

г) В питательную среду вносят 0,5% дрожжевого экстракта. Питательная среда с селективными свойствами.

Базовая среда Brucella-агар, селективные добавки: канамицин —75 мкг/ мл, ванкомицин — 75 мкг/мл.

Плотная среда в модификации Бектимирова. Тщательно очищенные от волосяного покрова голяшки овец вместе с роговым башмаком копытец заливают водопроводной водой и варят в зак­рытой кастрюле 2-3 часа до отделения тканей от костей. Полученный бульон фильтруют через бельтинг-ткань или ватно-марлевый фильтр. До­бавляют 0,5% пептона, 0,5% хлорида натрия и 2% агара. Кипятят до полно­го растворения агара, устанавливают рН 7,6 и стерилизуют при 120° С 30 минут. В расплавленную и остуженную до 45-50° С среду вносят асеп­тически 0,05% солянокислого цистеина (в виде 2%-ного раствора), 20% среды № 199,20%о дефибринированной крови лошади. Посевы инкубиру­ют в атмосфере углекислого газа.

Жидкая среда в модификации Бектимирова. Смешивают 650 мл бульона из голяшек овцы и 300 мл экстракта голов­ного мозга, добавляют 10 г пептона, 50 мл экстракта копытного рога, 5 г хлорида натрия. Стерилизуют при 120° С 30 минут и разливают по пробир­кам. Культивирование проводят в анаэростате в течение 24 ч.

Приготовление экстракта из головного мозга. Головной мозг овцы или крупного рогатого скота заворачивают в марлю, заливают водой и кипятят 15-20 минут, после чего выжимают и растирают в небольшом количестве мясо-пептонного печеночного буль­она (МППБ) до получения кашицеобразной массы. Полученную массу суспендируют в МППБ в соотношении 1:9 и автоклавируют при 120° С 30 минут. Отстоявшуюся после автоклавирования смесь центрифугиру­ют, надосадочную жидкость стерилизуют через фильтр Зейтца и хранят при 4° С.

Приготовление экстракта копытного рога. Копытный рог овцы высушивают и тонко измельчают до получения по­рошка, смешивают 1 часть порошка и 9 частей 0,8%-ного раствора хлори­да натрия. К полученной смеси добавляют 20% трипсина и инкубируют в течение 2-3 суток при 37° С, поддерживая рН 7,5-7,8. Смесь нагревают до 60° С, после чего фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизу­ют через фильтр Зейтца.

Лабораторная диагностика дизентерии свиней

Дизентерия свиней — инфекционная болезнь, характеризующаяся ге­моррагическим поносом и некротическим поражением толстых кишок. Восприимчивы свиньи всех возрастов, но чаще молодняк 1-6-месячного возраста. Возбудитель — анаэробная, грамотрицательная, извитая бактерия Serpulina hyodysenteriae (ранее Treponema hyodysenteriae), относится к роду Serpulina, семейству Spirochaetaceae. Род Serpulina содержит два вида, один из которых, S. innocens, не яв­ляется патогенным для свиней, обнаруживается в фекалиях здоровых Свиней и собак. Существуют данные, что S. hyodysenteriae проявляет спои патогенные свойства, только будучи в ассоциации с некоторыми другими представителями кишечной микрофлоры. Лабораторная диагностика дизентерии свиней основана на обнаружении возбудителя в исследуемом материале методом микроскопии, с помощью иммуноло­гических реакций, а также на выделении и идентификации культуры возбудителя.

Бактериологическое исследование

Прижизненно берут стерильным ватным тампоном фекалии из прямой киш­ки, плотно прижимая тампон к поверхности слизистой. Тампон помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором. У павших и убитых с диагностической целью животных не позднее двух часов после гибели берут соскобы слизистой пораженного сегмента кишки, предварительно освобожденного от содержимого. Материал также помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором (1-2 мл). Исследование про­водят в кратчайшие сроки после взятия (2-8 ч), в случае необходимости материал транспортируют в термосе со льдом.

Микроскопическое исследование исходного материала

Результаты микроскопического изучения материала имеют существенное диагностическое значение, поскольку культивирование возбудителя пред­ставляет трудную задачу. Морфологически S.hyodysenteriae и S.innocens неразличимы, поэтому существенно количественное содержание характер­ных спирохет в материале. У больных животных в одном поле зрения обыч­но обнаруживают 5-10 и более спирохет. Клетки S.hyodysenteriae грамотрицательные, спиралевидные, завитки крупные, правильной формы в количестве 2-4, может быть 8-10, концы заостренные, размер 0,3-0,4x7-9мкм.

Обнаружение S. hyodysenteriae в исследуемом материале проводят пу­тем темнопольной, фазовоконтрастной микроскопии или исследованием ок­рашенных препаратов.

Для обнаружения живых, подвижных трепонем берут 1-2 капли иссле­дуемого материала, готовят препарат «раздавленная капля» и просматрива­ют его в микроскопе с увеличением 280-400 раз (7-10x40, водная иммер­сия). Характер движения спирохет зависит от температуры: при 22°С наблю­дается изгибание клетки и медленное скольжение, при температуре 37-42°С — активное змеевидное поступательное движение. Кишечные кампи-лобактерии гораздо толще спирохет, имеют тупые концы, движутся, враща­ясь вокруг оси. Для увеличения контрастности можно к исследуемому мате­риалу добавлять каплю следующего красителя: метиленовый синий — 3 г, спирт этиловый 96°— 25 мл, 1%-ный раствор КОН — 1 мл, глицерин —10 мл, вода дистиллированная — 90 мл. Смешивают воду и спирт, затем растворя­ют метиленовый синий, смесь выдерживают при температуре 37°С в течение 48 часов, фильтруют и к фильтрату добавляют КОН и глицерин.

При изготовлении окрашенных препаратов мазки фиксируют над пла­менем горелки, но лучше этанолом или метанолом. Окрашивают по Гра-му, фуксином Пфейффера, по Романовскому-Гимза, краской виктория го­лубая. Последний краситель готовят следующим образом: в 5 мл этанола (абсолютного) растворяют 0,5 г виктории голубой 4-R, затем добавляют 95 мл дистиллированной воды, компоненты перемешивают. Мазки при этом методе окрашивания фиксируют 10%-ным формалином в течение 15 минут, окрашивают 5 минут раствором виктории голубой, промывают водой, под­сушивают на воздухе и исследуют с масляным иммерсионным объективом.

При наличии соответствующих иммунных сывороток обнаружение и идентификация возбудителя может быть проведена методом флуоресциру­ющих антител, иммуноферментным методом.

Выделение и идентификация культур S. hyodysenteriae

Культивирование. Возбудитель является анаэробом, растет в атмосфере, обогащенной СО₂ или N₂ 10% СО₂ температурный оптимум 42°С, при 30°С не растет, опти­мум рН питательных сред 7,0-7,2. Лучше растет на жидких средах с ОКВП выше 125 мВ и рН 6,9. Требует для роста холестерол, поэтому в среды добавляют бычий сывороточный альбумин или сыворотку крови. Поскольку исследуемый материал со­держит другие анаэробные контаминанты, то для первичной изоляции обыч­но используют плотные элективные среды с добавлением крови, так как по гемолитической активности ориентировочно можно дифференцировать S.hyodysenteriae и S. innocens, например кровяной агар на триптиказо-соевой основе или на базе перевара Хоттиигера.

Для культивирования (субкультивировапия) можно использовать жид-кую или полужидкую среды, содержащие сердечно-мозговую вытяжку и 10% эмбриональной телячьей или кроличьей сыворотки.

Исследуемый материал суспензирут в стерильном забуференном физио­логическом растворе 1:10, крупные частицы осаждают слабым центрифу­гированием или отстаиванием взвеси (20-30 минут). Надосадочную жидкость засевают на питательные среды в настольном боксе, освобожден­ном от кислорода. Рекомендуется для осво­бождения от контаминантов жидкость перед посевом последовательно пропускать через фильтры с уменьшающимся диаметром пор: 0,8-0,65- 0,45 мкм.

Культивирование осуществляют в анаэростатах типа ЛП-115, Лабор МИМ (Венгрия), вакуумных термостатах, заполненных газовой смесью, состоящей из 80% Н₂ и 20% СО₂, при 42°С в течение 48-72 часов.

Возможен несколько иной вариант выделения серпулин. В агаровой среде в чашке Петри вырезают углубление диаметром 2-10 мм и глубиной до 8-10 мм, но не доходящее до дна чаш­ки. В углубление вносят 0,2 мл пробы (суспензия каловых масс, содер­жимое кишечника), или, если углубление небольшое, пробу вносят в толщу агара уколом пастеровской пипетки в стенку углубления. Посевы инкубируют в анаэростате от 4 до 7 дней при 37° С. Серпулины могут мигрировать в агаре, в отличие от других бактерий, и растут (помутне­ние) на некотором расстоянии от углубления. Из периферической зоны помутнения часть агара переносят в восстановленную полужидкую (0,15%) среду, инкубируют и далее (для получения чистой культуры, поскольку возможно присутствие других спирохет) рассевают субкуль­туру на восстановленную плотную среду с целью получения изолированных колоний.

На кровяных плотных средах S. hyodysenteriae через 48 часов инкуби­рования образует плоские, прозрачные, с ровными краями, слизистой кон­систенции колонии диаметром 0,1-0,2 мм, с зоной четкого бета-гемолиза. S. innocens дает слабо выраженный бета-гемолиз.

Морфология клеток в культуре. Морфологию клеток из колоний исследуют в неокрашенных препара­тах методом темнопольной микроскопии или готовят окрашенные препа­раты. В окрашенных препаратах из первичных культур серпулины имеют 3-8 завитков, несколько крупнее (14-26x0,3-0,4 мкм), чем в дальней­ших пассажах. В субкультурах их длина обычно составляет 7-14 мкм, количество завитков — 2-4.

Идентификация S. hyodysenteriae по ферментативным признакам

С учетом происхождения исследуемого материала дифференцировать S. hyodysenteriae приходится от S. innocens. Отличия S. hyodysenteriae от кишечных вибрионов по морфологическим критериям изложены выше.

Для дифференциации видов рода Serpulina используют следующие кри­терии (табл. 89). Дифференциация этих двух видов серпулин наиболее доступна по характеру гемолиза, тес­там на интенсивность гемолиза и индолообразование.

Таблица 89 - Дифференцирующие признаки видов рода Serpulina

Признаки	S. hyodysenteriae	S.innocens
Сбраживание Фруктозы Мальтозы	_-	+
	+	-
Образование индола	+	-
β-гемолиз	выраженный	слабый
Тест на интенсивность гемолиза	+	-
Оптимальная температура	42° С	37° С
Патогенносць для свиней	+	-

¹⁾ S.hyodysenteriaeне ферментирует арабинозу, целлобиозу, эскулин, эрит­рит, галактозу, глюкозу, лактозу, гликоген, амигдалин, маннит, маннозу, меле-цитозу, рибозу, салицин, крахмал, сахарозу, трегалозу, ксилозу, кроме мальто­зы расщепляет глюкозу (Smibert, 1984).

Тест на интенсивность гемолиза проводят следующим образом. Культу­ру выращивают в течение 4 суток на агаровой среде, затем вырезают ага­ровый блок (0,5 см²), помещают его на свежий кровяной агар и инкубируют 4 дня. Если это культура S. hyodysenteriae, то по периметру агарового бло ка образуется светлая зона бета-гемолиза шириной 1-2 мм. S.innocens такой гемолитической реакции не дает.

Для выявления способности образовывать индол па поверхность агаро­вой культуры помещают индикаторную бумажку. S. hyodysenteriae, в отли­чие от S. innocens, образует индол, и бумажка синеет. Индикаторные бу­мажки пропитывают 1%-ным раствором пара-диметил-аминобензоальдегида в 10%-ном растворе соляной кислоты.