Выделение и идентификация культур микоплазм

Культивирова­ние. Выделение М.gallisepticum проводят в соответствии с действующей в РФ инст­рукцией по диагностике респираторного микоплазмоза из материала гото­вят суспензию 1:10 в МПБ с последующей ее обработкой ингибиторами (ацетат таллия, пенициллин) или фильтрацией через мембранные фильтры № 3,4. Посев производят на одну из питательных сред: Эдварда, Хоттингера, Мартена. Из головного мозга посев проводят без обработки материала ингибиторами. Посев материала, взятого тампонами из трахеи, воздухо­носных мешков, а также жидкости из синусов и суставов (0,1 мл) может быть проведен непосредственно в 3-5 мл жидкой питательной среды. При этом оптимальной жидкой питательной средой является среда Фрея, моди­фицированная для птичьих микоплазм. Для культивирования М.gallisepticum в среду Фрея добавляют свиную или лошадиную сыворот­ку. Инкубирование посевов проводят при 37° С в аэробных условиях до 14 суток, прежде чем результат исследования признают отрицательным. По­севы просматривают ежедневно на наличие роста, который проявляется легкой опалесцепцией и слабым помутнением среды. На среде Фрея за счет расщепления глюкозы рост возбудителя сопровождается изменением ее цве­та до оранжевого или желтого. Рекомендуется проводить до 4-5 слепых пассажей с интервалом между посевами в 5 дней, для чего 1 мл засеянной среды переносят в пробирку с 5-10 мл свежей среды без ингибиторов. Параллельно производят высев на аналогичную агаровую среду. Посев материала может быть произведен первоначально непосредственно на ага­ровые среды, однако предварительные пассажи на жидкой среде дают луч­шие результаты. Засеянные агаровые среды в чашках Петри инкубируют 3-5 дней при 37° С во влажной камере, во избежание подсыхания среды, лучше в атмосфере с 5% СО₂. Наличие колоний на плот­ных средах исследуют при помощи микроскопа (х20-х50) в косо падаю­щем пучке света. Типичные колонии имеют диаметр 0,1-1 мм, темный вра­стающий в питательную среду центр, прозрачную периферию (форма «яич­ницы-глазуньи»). В первичных культурах возвышающийся центр может от­сутствовать и проявляется у культур 2-3-го пассажа. Одновременно из культур готовят препараты, окрашенные по Романовскому-Гимза. В поло­жительных случаях в препаратах из седимента бульонной культуры или колоний обнаруживают коккоидные образования светло-фиолетового цве­та, диаметром около 0,25 мкм.

Патогенные микоплазмы вырастают на агаровых средах через 4- 5 дней, а непатогенные виды (М.gallisepticum, M.gallinarum, Acholeplasma) уже через сутки инкубирования. Для подавления роста непатогенных микоплазм реко­мендуется добавлять в среду соответствующие им иммунные сыворотки. Параллельно проводят дифференциацию обнаруженных колоний от L-форм бактерий.

Из отобранных колоний культуру отвивают в жидкую питательную среду или агаровым блоком на свежую агаровую среду без ингибиторов. Проце­дуру повторяют до получения чистой культуры.

Выделение культуры M.sinoviae. Подготовленный материал для выделе­ния этого вида микоплазм высевают на среду Фрея с 10-15% нормальной сыворотки свиньи, инактивированный при 56° С в течение 30 минут, кроме того, в среду добавляют 0,1% восстановленного никотинамида-адениндинуклеотида. Все последующие процедуры по получению чистой культуры возбудителя проводят по вышеописанной схеме.

Выделение культуры M.melagridis. Исследуемый материал для выделения M.melagridis лучше, как и для изоляции M.iowae, высевать на агаровую питательную среду с добавлением лошадиной сыворотки крови. M.melagridis отличается замедленным ростом. Коло­нии M.melagridis, M.synoviae и М.gallisepticum сходны по морфологии.

Идентификация культур микоплазм. Выделенные культуры микоплазм идентифицируют на основании изуче­ния ферментативных, культуральных особенностей, а также при помощи серологических методов. Исследование чувствительности к дигитонину и уреазной активности позволяет определить родовую принадлежность ми­коплазм (Mycoplasma, Ureaplasma, Acholeplasma). Определение способно­сти к ферментации глюкозы, аргинина и образованию фосфатазы дает воз можность отнести изолят к той или иной ферментативной группе. Дальнейшее изучение ферментативных характеристик позволяет устано­вить видовую принадлежность выделенной микоплазмы (табл. 98).

Таблица 98 - Дифференциальные признаки видов микоплазм,

выделяемых от птиц

Признаки

Вид микоплазм

М. gallisepticum

М. synoviae

М. melagridis

М. iowae

М. anatis

М. lipofaciens

М. columborale

М. gallopovans

М. pulloram

М. columbinasale

М. columbiunum

М. gallinarum

М. iners

М. gallinaceum

Глюкоза

+

+

-

+

+

+

+

+

+

_

_

_

_

+

Манноза

+

н.д.

-

н.д.

d

н.д.

_

н.д.

н.д.

н.д.

_

_

_

н.д.

Аргинин (гидролиз)

-

-

+

+

_

+

_

_

_

+

+

+

+

_

Фосфатаза

-

-

+

_

+

_

_

_

_

+

_

_

_

_

Пленки, пятна

-

+

-

-

+

+

_

_

—

+

+

+

+

_

Тетразол (редукция)

+ /+

-/w

-/+

+ /+

-/+

-/+

-/+

d/d

-/-

-/-

-/+

+ /+

-/-

-/-

Гидролиз желатина

-

н.д.

н.д.

н.д.

н.д.

н.д.

_

н.д.

н.д.

н.д.

_

_

_

н.д.

Свертывание и разжижение сыворотки

-

н.д.

н.д.

н.д.

н.д.

-

н.д.

н.д.

н.д.

н.д.

н.д.

-

-

н.д.

Расщепление казеина

-

н.д.

н.д.

н.д.

н.д.

н.д.

-

н.д.

н.д.

н.д.

-

-

-

н.д.

Гемадсорбирующие свойства

+

d

d

+

-

н.д.

Примечание: аэробно/анаэробно; н.д. — нет данных; d— варьирукющий признак.

Гемагглютинирующими свойствами обладают М.gallisepticum, M. sinoviae, M. iowae и иногда некоторые штаммы М. melagridis.

Серологическую идентификацию М.gallisepticum, M. synoviae, М.melagridis обычно осуществляют при помощи кроличьих антисыворо­ток в реакциях эпифлуоресценции, РДП, тесте ингибиции роста. Штаммы М. gallisepticum, M. sinoviae, M. melagridis и другие микоплазмы птиц име­ют внутривидовые варианты антигенных свойств, что может быть выявле­но путем электрофореза белков в полиакримидном геле.

Биопроба. При диагностике респираторного микоплазмоза биопробу проводят для вы­деления культуры возбудителя, а также для подтверждения патогенных свойств выделенной культуры микоплазм. Исследуемый материал вводят 7-9-дневным куриным эмбрионам в хориоаллантоисную полость в объеме 0,2 мл. Исследуют эмбрионы, погибшие через 48 часов и позднее после зара­жения. В положительных случаях обнаруживают отеки и кровоизлияния на коже головы, тела, лапках, застойные и дегенеративные изменения в парен­химатозных органах, отеки и кровоизлияния в околоплодных оболочках, аэросаккулиты, пневмонию. Обычно эмбрионы погибают на 5-7-е сутки. Однако часто требуется один или более пассажей, прежде чем наступают характерные изменения и гибель эмбрионов. При первичном заражении за положительный результат принимают гибель 50% и более зараженных эмб­рионов при выживании контрольных.

При диагностике инфекции, вызванной возбудителем М.synoviae заражают бульонной культурой интраплантарно, интраартикулярно цыплят, индюшат и через 3-5 недель в РПГА или РДП регистрируют появление в крови антител к возбудителю, что позволяет типировать изолированную культуру. Заражение куриных эмбрионов вызывает их гибель на 4-14-е сутки.

Испытание патогенных свойств М. meleagridis показало штаммовую вариабельность вирулентных свойств возбудителя. При заражении куль­турой возбудителя куриных эмбрионов гибели не наблюдают. В резуль­тате заражения 7-14-дневных эмбрионов у 30-70% вылупившихся ин­дюшат обнаруживают патологические изменения.

Штаммы М. iowae варьируют по вирулентным свойствам, некоторые штаммы вызывают гибель куриных и индюшиных эмбрионов при зараже­нии в желточный мешок.