Выделение и идентификация бордетелл

Культивирование. Бордетеллы — строгие аэробы, температурный оптимум 37-38° С, рН питательных сред 7,2-7,6. Посев исследуемого материала проводят на кровяной, сывороточной агар, агар Мак-Конки. Поскольку объектом ис­следования чаще всего является контаминированный посторонней микро­флорой материал (носовая, трахеальная слизь), то предпочтительнее посев производить на элективные среды. При этом необходимо учитывать, что при наличие в материале бактерий, расщепляющих углеводы, может тормозить рост бордетелл, так как бордетеллы требуют слабощелочных или нейтраль­ных значений среды, а контаминанты закисляют ее. Из числа элективных сред для изоляции В. bronchiseptica используют кровяной агар с клиндами-цином и неомицином, пенициллиннитрофурантоиновый агар, среду Мак-Конки, среду Smith и Baskerville с гентамицином, пенициллином, фуранта-доном (SB-среда). B.avium на SB-среде культивируют без внесения антиби­отиков. Посевы инкубируют в условиях обычной атмосферы в течение 24-48 часов.

B.bronchiseptica на кровяном (овца, лошадь) агаре формирует через 24 часа очень мелкие, выпуклые, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии, обычно с зоной β-гемолиза. В наибольшей степени гемолитичес­кая активность выражена на среде Борде-Жангу (рН 6,2-6,8). Колонии B.avium аналогичного типа, но обычно негемолитичные. На МПА свеже-выделенные культуры образуют гладкие, полупрозрачные, с блестящей по­верхностью колонии диаметром 0,2-1,5 мм, которые позднее (48-72 часа) становятся серо-белыми. В зависимости от культуральных вариаций могут быть выявлены колонии трех типов: S-форма — 1-й тип, SR-форма — 2-й тип, R-форма — 3-й тип. На агаре Гартоха колонии имеют беловатый цвет, на агаре Мак-Конки колонии мелкие, с розоватой периферией и светлым центром. На селективной среде Smith-Baskerville (SB-среда) колонии

B.bronchiseptica и В. avium через сутки инкубирования имеют размер около 0,5 мм, голубой цвет и с голубым окрашиванием среды вокруг колонии, что свидетельствует о защелочении рН в зоне роста, позднее колонии дос­тигают размера 1,5-2,0 мм. Сходные по культуральным признакам сахаролитические бактерии вызывают закисление рН, поэтому колонии и окру­жающая среда приобретают желтоватый цвет. В жидких питательных сре­дах (сывороточный МПБ) бордетеллы растут с равномерным помутнением среды, в последующем образуется осадок и пристеночное кольцо, среда становится прозрачной.

Морфология клеток бордетелл в культуре. Морфология клеток в окрашенных препаратах из культур и патологи­ческого материала сходна. Капсул не образуют. B.bronchiseptica и B.avium, в отличие от В.parapertussis и B.pertussis, имеют жгутики, поэтому обяза­тельно исследуют выделенную культуру на подвижность.

Идентификация бордетелл на уровне рода. Бактерии рода Bordetella по морфологическим и тинкториальным свойствами сходны с бруцеллами, гемофильными бактериями и вида­ми рода Alcaligenes. Для дифференциации от этих бактерий исследуют способность к росту в анаэробных условиях (гемофилы являются фа­культативными анаэробами); ферментацию углеводов (бордетеллы не закисляют среды с углеводами); потребность в никотинамиде (борде­теллы зависят от этого ростового фактора); редукцию нитратов (бор­детеллы и гемофилы всегда редуцируют нитраты); окисление амино­кислот (бордетеллы, в отличие от гемофильных бактерий, окисляют аминокислоты); редукцию тетразолия (бордетеллы, в отличие от видов рода Alcaligenes, редуцируют этот субстрат); утилизацию цитратов (В.hronchiseptica использует цитраты); защелочение лакмусового мо­лока (защелачивают бордетеллы и алкалигенес); способность к росту в питательных средах, содержащих 320 мг/л теллурита калия (борде­теллы не растут). Данные дифференцирующие признаки представлены в таблице 77.

Таблица 77 - Дифференциальные признаки бактерий рода Bordetella

и сходных с ним по морфологическим свойствам родов

Признаки	Роды
	Bordetella	Brucella	Haemophilus	Alcaligenes
Строгие паразиты	+	+	+	-
Сапрофиты	-	-	-	+
Строгие аэробы	+	+	-	+
Потребность в ростовых факторах: тиамине	-	+	-	-
никотинамиде	+	-	-	-
X(илиV)	-	-	+	-
Ферментация углеводов	-	-	+	-
Редукция нитратов	Р	+	+	Р
Подщелачивание лакмусового молока	+	-	-	+
Окисление аминокислот	+	+	-	+
Редукция тетразолия	+	н.д.	+	-
Рост в присутствии 320 мг/л теллурита калия	-	н.д.	-	+
Утилизация цитратов	Р	-	-	+

н.д. — нет данных; Р — признак различен в таксонах рангов (виды рода).

Идентификация бордетелл на уровне вида. С целью дифференциации видов внутри рода Bordetella исследуют под­вижность клеток изолированной культуры, наличие гемолитической актив­ности, способность к росту на агаре Мак-Конки, скорость роста на среде Борде-Жангу, продукцию бурого пигмента на пептонном агаре, морфо­логию колоний на SB-среде, редукцию нитратов, образование уреазы, оксидазы, утилизацию цитрата. При наличии системы API можно дополнительно определить использование в качестве единственного источ­ника углерода ацетата, адипината, мезо-татрата, итаноната, сукцината. В. hronchiseptica способна утилизировать перечисленные субстраты, В.avium не использует мезо-татрат и итанонат.

Серологическая идентификация бордетелл. При наличии бордетеллезных агглютинирующих сывороток медицинс­кого назначения можно провести серологическую идентификацию В. hronchiseptica и В. parapertussis.

Серологическая идентификация может быть осуществлена на этапе просмотра первичных посевов. При обнаружении подозрительных колоний из них делают мазки, окрашивают по Граму. Если клетки соответствуют

Таблица 73 - Дифференциация видов рода Bordetella, патогенных для животных

Признаки	Виды бордетелл
	B.bronchiseptica	B.avium	B.parapertussis
Подвижность	+	+	-
β-гемолиз	+ 1)	-	-
Появление колоний на среде Борде-Жангу (дни)	1-2	1-2	2-3
Продукция бурого пигмента при росте на пептонном агаре	-	D	+
Морфология колоний на SB-среде	мелкие, голубые	мелкие, голубые	н.д.
Редукция нитратов	+	-	-
Уреаза	+	-	+
Оксидаза	+	+ 2)	-
Использование в качестве ис­точника углерода цитрата	+	+	+
Рост на агаре Мак-Конки	+	+	+

Таблица 78 - Антигенная структура видов рода Bordetella

Антигены	Виды бордетелл
	В .bronchiseptica	B.parapertussis	В.pertussis
К-антигены общий для рода фактор 7	+	+	+
Специфические для рода факторы: 1	-	-	+
14	_ -	-_	+
12	+	-	-
Встречающиеся у отдель­ных штаммов факторы: 2,3,4,5,6, 13			+
8,9, 10		+
8,9, 10, 11, 13	+
О-антиген, общий для ро­да	+	+	+

морфологическим и тинкториальным характеристикам бордетелл, то культуры проверяют в РА на стекле с родовой бордетеллезной сыво­роткой. В составе клеток бордетелл установлено наличие 14 антиге­нов (факторов). Родовым антигеном является фактор 7, который встре­чается у всех бордетелл. Видовыми факторами для В. bronchiseptica является антиген 12, для В. parapertussis — 14. Типовыми факторами для В. bronchiseptica определены 8, 9, 10, 11, 13, для В. parapertussis — 8, 9, 10. Реакцию агглютинации на стекле ставят с адсорбированными видовыми факторными сыворотками, используя 48-часовые культуры Используя иные факторные сыворотки, можно определить серотип.

Биопроба. Для подтверждения патогенности выделенных культур бордетелл у них определяют наличие токсигенных и адгезивных свойств. В. bronchiseptica и В. avium синтезируют иммунологически не тождествен­ные дермонекротические токсины, которые выявляют внутрикожной инъекцией на морских свинках. При введении молодых культур возбу­дителей внутрибрюшинно можно наблюдать летальный эффект. С це­лью обнаружения адгезинов В.bronchiseptica бактериальную массу из двух колоний суточной культуры суспендируют на предметном стекле в капле физиологического раствора и добавляют равный объем 3%-ной взвеси отмытых эритроцитов барана. В положительных случаях агглютинация наступает через 1-2 минуты. В качестве контролей используют суспензию бактерий без эритроцитов и суспензию эритроци­тов без бактерий.

Питательные среды

Селективная среда Smith-Baskerville (SB-среда)

Основную питательную среду, состоящую из 870 мл дистиллированной Воды, 20 г пептона, 5 г натрия хлорида, 15 г агара, автоклавируют при И 21° С в течение 15 минут, охлаждают до 55° С и вносят добавки.

Антимикробная добавка: гентамицин — 0,5 мкг/мл, пенициллин — 20 мкг/мл, фурантадон —20 мкг/мл. Углеводная добавка: 10%-ный раствор (стерильной глюкозы —100 мл, 10%-ный раствор лактозы —100 мл.

Индикатор: бромтимоловый синий 0,2%-ный раствор — 40 мл. Инди­катор готовят, добавляя к 475 мл дистиллированной воды 250 мл 0,1N ед­кого натрия и 1,0 г бромтимолового синего.

Компоненты перемешивают и готовую среду разливают в чашки Петри.

Кровяной агар с селективными добавками. К базовой питательной среде добавляют клиндамицин до конечной концентрации 2 мкг/мл и неомицин — 4 мкг/мл.

Лабораторная диагностика инфекционного кератоконъюктивита крупного рогатого скота

Моракселлы являются грамотрицательными аэробными бактериями, отно­сятся к роду Moraxella, обитают на слизистых конъюнктивы и носоглотки клинически здоровых животных. Основной патогенный вид рода — М. bovis, вызывает инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, его также выделяют при конъюнктивитах лошадей. Болезнь возни­кает на фоне предрасполагающих факторов, преимущественно у молодых животных до двухлетнего возраста. В этиологии болезни в качестве основ­ного предрасполагающего фактора рассматривают действие естественно­го (солнечного) ультрафиолетового излучения.

Бактериологическое исследование

Объектом исследования является конъюнктивальный секрет. Возбудитель отличается малой устойчивостью, поэтому материал помещают в небольшой объем (1-2 мл) стерильного физиологического раствора и исследуют не позднее двух часов после взятия, лучше производить посев на питатель­ные среды непосредственно в момент взятия материала.

Микроскопическое исследование исходного материала

При микроскопии приготовленных препара­тов, окрашенных по Граму, находят короткие, вплоть до кокков, толстые, капсулированные грамотрицательные палочки размером 1,0-1,5 х 1,5-2,5 мкм, распо­лагающиеся преимущественно парами, иногда — в виде цепочек.

Выделение и идентификация М. bovis

Культивирование. Для большинства видов рода, и в том числе для М. bovis, характерны сложные пищевые потребности. Моракселлы растут на средах, обогащен­ных кровью или сывороткой крови, температурный оптимум 33-35° С, рН 7,2-7,6, аэробы. Материал засевают на кровяной или «шоколадный» агар и посевы культивируют в условиях обычной атмосферы в течение 2-3 су­ток. На простом агаре возбудитель не растет.

Через 48-72 часа на кровяном агаре с кровью крупного рогатого скота или лошади образуются округлые, выпуклые или плоские серо-бе­лые колонии диаметром до 1 мм, с зоной бета-гемолиза или без него. Счи­тается, что гемолитичность — признак вирулентности штаммов. На «шо­коладном» агаре зона гемолиза имеет темный цвет. Штаммы, выделен­ные от лошадей, проявляют гемолитические свойства только на «шоко­ладном» агаре. Колонии обычно врастают в агар. Консистенция бакте­риальной массы крошковидная, и взвесь бактерий в физиологическом ра­створе нестабильна. В последующих пассажах колонии имеют мягкую консистенцию, и бактериальная суспензия из них в физиологическом ра­створе не вьгладает в осадок.

Морфология клеток моракселл в культуре. Морфология клеток в культуре и исходном материале однотипная, но на питательных средах часто появляются признаки полиморфизма: клетки варьируют по размеру, форме, могут присутствовать нити. Особенно силь­но полиморфизм проявляется при недостатке кислорода, превышении тем­пературы. Клетки жгутиков не имеют, может быть капсула.

Идентификация М. bovis на уровне рода. Группа сходных с моракселлами грамотрицательных палочковидных бак­терий и кокков весьма обширна. Общим свойством моракселл и ряда сходных бактерий является отсутствие способности расщеплять углеводы с образовани см кислоты. Внутри этой группы неффментирующих углеводы грамотрицатель­ных бактерий моракселлы даффереицируют по признакам, изложенным в табли­це 79.

Идентификация моракселл на уровне подрода и вида. Род Moraxella подразделяется на подроды Moraxella и Branhamella. К первому относятся виды, имеющие палочковидную форму с тенденцией к образованию кокков, ко второму — виды, представленные исключительно кокковыми клетками.

Таблица 79 - Некоторые дифференцирующие признаки моракселл и других неферментирующих углеводы бактерий

Признаки			Род бактерий
	Moraxella	Pseudo-monas	Alca-ligcnes	Achromobacter	Acinetobacter	Flavobacterium
Образование пигмента	-	X	-	-	-	+
Оксидаза	+	X	+	+	-	+
Рост на простом МПА	-	+	+	+	+	+
Подвижность	-	+	+	+	-	-

Как видно, моракселлы в этой группе представляют единственный род, бактерии которого не растут на простом агаре.

М. bovis внутри подрода Moraxella от других видов дифференцируют по гемолитической, желатиназной, оксидазной, каталазной, фенилаланиндезаминазной, уреазной активности, способности к росту на агаре Мак-Конки.

Для М. bovis характерно нали­чие гемолитической активности, оксидазы, желатиназы (инкубация 7-14 суток), пептонизация лакмусового молока, чувствительность к пеницилли­ну, образование каталазы и редукция нитратов приблизительно у 14% штам­мов, отсутствие образования кислоты из Д-глюкозы, Д-ксилозы, Д-маннита, лактозы, сахарозы, мальтозы, фенилаланиндезаминазы, уреазы на сре­де Кристенсена, утилизации цитрата на среде Симмонса, образования ин­дола. Возбудитель образует H₂S, что выявляется в тесте с бумагой, пропи­танной ацетатом свинца, но отсутствует выделение H₂S при посеве в стол­бик TSI. M. bovis не растет на среде Мак-Конки.

Таким образом, к виду М. bovis относят культуры бактерий, не обра­зующие пигмент, фенилаланиндезаминазу,уреазу, чувствительные к пени­циллину, не растущие на простом МПА, агаре Мак-Копки. Достаточно характерен рост М. bovis в лакмусовом молоке, при этом верхняя щелочная часть среды приобретает синий цвет, казеин пептонизируется. Для биохи­мической идентификации подходит тест-система Enterotest 24 (PLIVA-Lachema) и ее аналоги.

Таблица 80 - Критерии дифференциации моракселл внутри рода Moraxella

Признаки	Вид бактерий
	М. bovis	М. lacunata	М. phenyl-pyruvica	М. osloensis	М. nonli-quefaciens	М. atlantae
Гемолиз	(+)	-	-	-_	-_	-
Желатиназа	(+)	+	-	-	-	-
Оксидаза	+	+	+	н.д.	Н.Д.	Н.Д.
Каталаза	(-)	+	+	Н.Д.	н.д.	Н.Д.
Фенилаланин-дезаминаза	-	-	(+)	-	-	-
Уреаза	-	-	-	-	-_
Рост на агаре Мак-Конки	-	-	(+)	Н.Д.	Н.Д.	Н.Д.
Чувствительность к пе­нициллину 1 ЕД/мл	+	+	+	+	+	+

( + ) — большинство штаммов положительные или отрицательные.

Биопроба. С целью подтверждения патогенных свойств выделенной культуры можно заражать внутрибрюшинно белых мышей. Вирулентные штаммы вызыва­ют летальный исход. Косвенным признаком вирулентности является четко выраженная гемолитическая активность.

Лабораторная диагностика инфекционного тромбоэмболического менингоэнцефалита крупного рогатого скота

Инфекционный тромбоэмболический менингоэнцефалит крупного рогато­го скота (ИТЕМЕ) — инфекционная остропротекающая септическая бо­лезнь, характеризующаяся симптомами поражения центральной нервной си­стемы, органов дыхания, гениталий и суставов конечностей. Болезнь, как правило, развивается в виде респираторного синдрома, а на септической стадии поражаются различные органы и ткани. У овец возбудитель обна­руживается как комменсал генитального тракта и может быть причиной орхитов, эпидидимитов, пневмоний, маститов, полиартритов, септицимий.

Возбудитель — бактерия Haemophilus somnus. Исследования гомологии ДНК показали, что виды Histophilus ovis, Haemophilus agni и Haemophilus somnus представляют собой один вид, который должен быть исключен из рода Haemophilus и перенесен в род Histophilus.

Лабораторная диагностика ИТЕМЕ основана на результатах бактериологи­ческого исследования.