Индикация и идентификация вируса

Электронная и иммуноэлектронная микроскопия. Возбудителя болезни определяют по ультраструктуре, выявляемой с помощью негативного контрастирования, а также марки­ровки вируса гипериммунной сывороткой. За положительные результаты ЭМ считают нали­чие в препаратах вирионов размером 70-120 нм, на оболочке которых размещены булаво­видные шипы, характерные для коронавирусов. В препаратах, обработанных иммунной сы­вороткой к вирусу, на оболочках вирионов обнаруживают скопления белковых молекул. В контрольных препаратах, обработанных гетерологичной иммунной сывороткой, таких скоп­лений нет. Иммуноэлектронная микроскопия более чувствительный метод.

Гистологические исследования. Кусочки ткани двенадцатиперстной, тощей и под­вздошной кишок фиксируют в 10%-ном забуференном р-ре нейтрального формалина, гото­вят из них гистологические препараты при помощи обычных методов и исследуют под мик­роскопом на наличие поражений, характерных для ИГС. Особенно характерно наличие ат­рофии кишечных ворсинок, которая наиболее ярко выражена в первые 3-4 дн после начала болезни. Соотношение длины ворсинок тощей кишки к глубине крипт у здоровых животных составляет 7:1, у больных ИГС около 1:1. Наиболее характерными изменениями являются выраженная дегенерация эпителия слизистой оболочки кишечника, поверхност­ный некроз эпителия кишечника и кишечных ворсинок. Для уточнения диагноза в условиях практики рекомендуется убить 2-3 больных поросят, взять небольшие участки тощей и под­вздошной кишок (10-15см), продольным разрезом вскрыть слизистую оболочку, осторожно промыть её физиологическим р-ром и погрузить в дистиллированную воду, затем просмот­реть под лупой при увеличении в 60-80 раз (например, МБС 6 или МБС 9) и верхнем осве­щении на предмет состояния ворсинок. Укорочение их служит подкрепляющим патологоанатомическим тестом в подозрении на ИГС. Контролем при этом служит аналогичная часть кишечника от клинически здорового поросенка или передний отрезок (5-7 см от пилорического сфинктера) 12-перстной кишки. Помимо атрофии ворсинок в тонком кишечнике, в протоплазме эпителиальных клеток выявляют вакуоли.

Взаимодействие вируса с энтероцитами тонкого кишечника сопровождается глубокими деструктивными изменениями их апикальной части, а в более поздние сроки болезни - всей клетки. Для этих изменений характерны полная потеря микроворсинок, нарушение целост­ности плазматической оболочки и полный лизис клетки. Вследствие указанных поражений энтероциты кишечника не способны выполнять нормальные процессы адсорбции, всасыва­ния, пристеночного пищеварения и другие физиологические функции.

Метод интерференции. Встречаются полевые штаммы ВИГС, которые хорошо раз­множаются в клеточных культурах, но не проявляют ЦПД. Для обнаружения нецитопатогенных изолятов в монослое культур клеток свиных почек используют феномен интерфе­ренции. Такие шт. тормозят развитие ЦПД в культурах клеток, инфицированных ВД-БС КРС. Аналогичные результаты получены и при применении интерфероногенных шт. ВБА.

Метод иммуноцитолиза. Метод иммуноцитолиза использовался в Чехословакии для идентификации ВИГС в культуре клеток СПЭВ.

ИФ. Её используют для быстрой индикации и идентификации АГ ВИГС в культуре кле­ток, инфицированных вирусным материалом, а также мазках-отпечатках, гистологических срезах патологического материла (фрагментов тонкого кишечника) от животных, естествен­но-больных или заболевших после экспериментального заражения. РИФ применяют в пря­мом и непрямом вариантах по общепринятым методикам. ИФ считается положительной при наличии в препаратах ярко-зеленого свечения клеток или цитоплазмы с ярко светящимися гранулами разного размера при отсутствии флюоресценции в контрольных препаратах. Свечение лейкоцитов и дегенеративно измененных клеток не учитывается. Выявление виру­са может быть успешным, если исследования проводятся на поросятах не позднее чем через 24 ч после их заболевания. Наибольшее количество флюоресцирующих эритроцитов обнаруживают до и с наступлением диареи, позже число их невелико. Наиболее эффективным методом диагностики болезни оказалось исследование в РИФ замороженных срезов тощей кишки животных, убитых в период острой фазы заболевания. Однако, по мнению других исследователей, метод мазков-отпечатков миндалин с помощью прямой РИФ превосходит исследования тощей кишки.

Для ИФ диагностики ИГС применяли меченый конъюгат против вирусного перитонита кошек. Такие конъюгаты готовили из перитонеальной жидкости больной кошки с титром AT в жидкости не ниже 1.2560. Конъюгат анти-ВИГС получают из иммунной сыворотки поросят, свободных от патогенной микрофлоры, титр AT 1:256. При исследовании срезов слизистой оболочки тонкого кишечника поросят, зараженных вирусом, получены одинако­вые результаты с конъюгатом анти-ВИПК и анти-ВИГС равной интенсивности свечения. При исследовании с помощью конъюгата анти-ВИГС срезов селезенки кошек, зараженных ВИПК, получены отрицательные результаты. Это свидетельствует об одностороннем анти­генном родстве между этими вирусами. Таким образом, для диагностики ИГС можно с ус­пехом использовать конъюгаты анти-ВИПК. Поскольку наличие у кошек AT к вирусам сви­ней маловероятно, перитонеальная жидкость, полученная при заражении вирусом перитони­та, может служить хорошим препаратом для изготовления диагностического конъюгата. Конъюгаты к ВИГС, полученные из иммунной сыворотки поросят, могут давать неспецифи­ческую флюоресценцию.

Для диагностики ИГС ИФ в качестве источника AT предложено иммунное молозиво. Показано, что концентрация иммуноглобулинов в молозиве даже выше, чем в сыворотке крови. ИФ как метод диагностики имеет ряд проблем, главная из которых наличие перекре­стной реакции с ВИПК, КВС и РКВС. Поликлональные AT не дифференцируют ВИГС и РКВС, некоторые монАТ реагируют с ВИГС и не реагируют с РКВС. Такая дифференциа­ция может быть проведена как в ИФ, так и в ИФА. РКВС обнаруживается в респи­раторных тканях и эпителиальных клетках носовой полости, но тем не менее для дифферен­циации необходимо спользовать монАТ, поскольку ВИГС может также реплицироваться в указанных органах.

РН. При выделении вируса в культуре клеток его идентификацию проводят с помощью РН, используя 1000 ТЦД₅₀ вируса и 20 нейтрализующих доз сыворотки (вирус и сыворотку предварительно титруют).

Помимо культуры клеток для идентификации вируса, изолированного в биопробе, ста­вят РН на восприимчивых поросятах в возрасте 1-5 дн.

ВИЭОФВ. Вирус ИГС в этой реакции образует 1-2 линии преципитации с гомологич­ными сыворотками и может быть легко выявлен в экстрактах из содержимого кишечника экспериментально зараженных поросят. Богатая АГ структура (наличие трех АГ с различной электрофоретической подвижностью) позволила использовать для его обнаружения модифицированную методику ВИЭОФ (двойной ВИЭОФ), повышающую результативность.

ELISA. Разработан ELISA - метод с использованием монАТ и поликлональных AT для выявления АГ ВТГС в различных материалах: культуральном и очищенном вирусах, смы­вах тонкого кишечника или фекалиях экспериментально инфицированных поросят. Метод пригоден для обнаружения вирулентного полевого штамма, не адаптированного к культуре клеток. Метод специфический, быстрый и недорогой.

Идентификация с помощью монАТ. Показано существование 6 различных эпитетов ВИГС (шт. ТО-163). Антигенная вариабельность вируса имеет эпизоотологическое значение и должна подтверждаться с помощью монАТ. Метод гибридизации нуклеиновых кислот не­давно разработан для обнаружения ВИГС по геномной последовательности в образцах кала или инфицированных тканей. Остатки (фрагменты) РНК 5¹-конца ВИГС пепломерного гена не отличаются от ВТГС и РКВС. В исследованиях избирательно дифферентровали кишечные ВИГС изоляты из США, Японии, Англии, живые аттенуированные ВИГС вакцинные штаммы из США, изоляты РКВС, ВИПК и КВС.