Питательные среды

«Шоколадный» агар. Готовят обычным способом (см. «Возбудитель гемофилезного полисе­розита поросят») на базе агара Мартена, Хоттингера (рН 7,2-7,4) с до­бавлением 10% крови лошади.

Селективный агар с амфотерицином и кристаллвиолетом. К расплавленному и остуженному «шоколадному» агару добавляют амфотерицин В (5 мкг/мл) и кристаллвиолет (1 мкг/мл).

Селективный агар со стрептомицином. К расплавленному и остуженному до 45° С «шоколадному» агару до­бавляют раствор стрептомицина из расчета конечной концентрации 200 мкг/мл.

Лабораторная диагностика сапа

Сап - инфекционная болезнь однокопытных, протекающая преимуществен­но хронически, характеризующаяся возникновением на слизистых оболоч­ках, во внутренних органах узелков, склонных к казеозному распаду с фор­мированием язв. Восприимчивы лошади, ослы, мулы, а также львы, тигры, рыси, белые и бурые медведи. Болеет человек, но если у животных в 90% случаев наблюдается хронический сап, то у людей, как правило, он прояв­ляется в острой форме.

Возбудитель болезни — грамотрицательная, аэробная палочковид­ная бактерия Burkholderia mallei, род Burkholderia, семейство Pseudomonadaceae (ранее Pseudomonas mallei). Лабораторная диаг­ностика сапа животных основана на результатах бактериологичес­кого и серологического исследований. Основными методами диагно­стики являются серологические, к бактериологическому исследова­нию прибегают редко и проводят его только в специализированных лабораториях.

Бактериологическое исследование

Для исследования берут мокроту, гной, отделяемое вскрывшихся абсцессов, пунктаты абсцессов, пораженные участки органов, лимфатические узлы, кровь. При отсутствии патологических изменений — легкие с регионарными лимфа­тическими узлами, подчелюстные и заглоточные лимфоузлы. При необходи­мости материалы консервируют 30%-ным раствором глицерина, хранение ма­териала при 4° С в этом случае допускается до 10-15 суток.

Микроскопическое исследование исходного материала, обнаружение антигенов B.mallei в материале

Мазки из материала окрашивают по Граму, метиленовой синькой Леффлера, по Романовскому-Гимза. В. mallei представляют собой тонкие, прямые или слегка изогнутые грамотрицательные палочки с закругленными кон­цами размером 0,5-1 х 2-4 мкм. При окраске по Романовскому-Гимза, синькой Леффлера, в клетках, за счет гранул поли-β-гидроксибутирата, выявляется зернистость, что нередко приводит к биполярной окраске. Ис­пользуют иммунологические методы обнаружения возбудителя в исследуе­мом материале (МФА, ИФА, РНГА).

Выделение и идентификация культур B. mallei

Культивирование. Burkholderia mallei — строгий аэроб, температурный оптимум — 37° С, диапазон 20-45° С, оптимум рН 6,5-7,2, к питательным средам не требо­вателен, лучше растет на средах с глицерином (4-5%). Исследуемый ма­териал высевают на глицеринизированный МПА, МПБ, кровяной МПА. Для подавления роста сопутствующей миклофлоры в питательные среды рекомендуется вносить основной фуксин 1:10 000, кристаллический фио­летовый 1:200 000, бриллиантовый зеленый 1:100 000. Посевы культивируют при 37-38° С. Макроскопически ви­димый рост обнаруживается уже через 24-48 часов инкубирования, ред­ко — позже.

На глицеринизированном агаре возбудитель образует через сутки круг­лые, плоские, серовато-белые, с перламутровым блеском, полупрозрачные колонии слизистой консистенции, постепенно сливающиеся в тягучий, про­зрачный налет. На картофельно-глицериновой среде возбудитель синтезиру­ет пигмент, что считается важным диагностическим признаком; через 2-3 суток на картофельных пластинах вырастают мелкие, полупрозрачные, с желтоватым оттенком колонии, которые сливаются. Образуется слизистый медообразный налет, цвет которого меняется от янтарно-желтого (1-3 дня) до буро-коричневого или буровато-красного (6-8 дней). Независимо от цвета колонии сохраняют свою прозрачность. В МПБ (1-5% глицерина) возбуди­тель вначале растет в виде мутной взвеси, через 48 часов формируется при­стеночный осадок в виде слизистых тяжей, часто нежная сероватая слизис­тая пленка. Образующийся осадок при встряхивании поднимается в виде тяжей, среда полностью не просветляется. При посеве уколом в желатину наблюдается поверхностный рост в виде сероватого налета в верхней части укола. Желатина не разжижается, иногда в зоне роста наблюдается желтое окрашивание.

Морфология клеток B.mallei в культуре. При выращивании на питательных средах возбудитель проявляет склон­ность к полиморфизму: образуются более мелкие клетки (кокковидные фор­мы), выявляются цепочки, концы клеток могут быть закругленными, заостренными или со вздутиями. В старых культурах на М П Б формируются нити из 4-8 клеток. Спор, капсул, жгутиков клетки не образуют, зернистость в клетках старых культур окрашивается метахроматично.

Идентификация выделенных культур B.mallei. Выделенные культуры после микроскопического исследования пересе­вают на глицеринизированный картофель. На стадии изучения подозритель­ных культур используют иммунологические методы идентификации возбу­дителя: РА, РНГА, МФА, ИФА. У выделенных чистых культур исследуют способность к росту при разных температурах, на разных питательных сре­дах, ферментативные характеристики. Ключевыми тестами для дифференциации P.mallei от других псевдомонад является тест Хью — Ляйфсона, образование кислоты из глюкозы, отсут­ствие кислоты на среде с сахарозой, утилизация цитрата на среде Симмонса, восстановление нитрата, отсутствие газа из нитрата, лизиндекарбоксилазы, неспособность к росту при 42° С, синтез аргининдигидролазы (табл. 78). При дифференциации B.mallei от наиболее сходного вида B.pseudomallei существенны тесты на подвижность, образование газа из нитрата, способность к росту в МПБ без NaCl, пептонизация молока, обра­зование орнитиндекарбоксилазы.

Серологическая идентификация B.mallei. На стадии работы со смешанными, а позже — с чистыми культурами серологическая идентификация возбудителя может быть проведена в ИФА, МФА, РНГА, РА, РП.