Характеристика неподвижной фазы

Состав анализируемых веществ	Неподвижная фаза	Максимальная допустимая температура, °С
Смесь метиловых эфиров монокарбоновых кислот с разной длиной цепи	Апиезон L	300
Смесь метиловых эфиров монокарбоновых кислот с разной степенью насыщенности	Полиэфиры: полиэтиленгликольадипат (ПЭГА) полиэтиленгликольсукцинат (ДЭГС) реоплекс 400	200 220 200
Смесь метиловых эфиров и дикарбоновых кислот	Полидиэтиленгликольсукционат Апиезон L	220 300
Смесь спиртов	Апиезон L Силиконовая смазка Резофлекс 446	300 250 220
Смесь ацетатов спиртов	Реоплекс 400 и другие полиэфиры	200
Смесь триглицеридов	SЕ 30	350

Нанесение неподвижной фазы на носитель. В целях равномерной пропитки твердого носителя жидкостью ее растворяют в летучем растворителе, твердый носитель заливают раствором и растворитель медленно испаряют на водяной бане при перемешивании. Затем пропитанный жидкой фазой носитель сушат в токе инертного газа. Соотношение между жидкостью и носителем зависит от цели исследования, величины пробы, а следовательно, от чувствительности детектора. Обычно количество жидкости составляет 5…30 % от массы твердого носителя.

Заполнение колонок. Небольшую порцию высушенного наполнителя вносят в колонку, уплотняя его при помощи вибратора. Колонку берут за концы двумя руками и, прикасаясь к вращающемуся валу вибратора, осторожно водят ее вверх-вниз, уплотняя материал. Аналогичные действия повторяют с каждой порцией наполнителя, при этом каждый рукав колонки (если она имеет U-образную форму) заполняется отдельно. Когда весь материал введен в колонку, его закрывают кусочками стеклянной ваты. Нужно внимательно следить за тем, чтобы не было пустот при заполнении колонок. Излишняя плотность набивки затрудняет движение потока газа-носителя, а слишком рыхлая набивка уменьшает эффективность работы колонки. Заполненные колонки прогревают в течение суток при температуре 185…200 °С в токе газа-носителя. Они могут служить для проведения очень большого количества анализов. Если со временем в колонке появятся разрывы, то наполнитель из колонки высыпают и вновь заполняют такой же порцией, если фаза еще сохранила свою активность.

Количество материала, необходимое для заполнения колонки рассчитывают по формуле

М = V, (9.6)

где V – объем колонки, мл; ρ – насыпная масса материала, г/мл. Для цеолита ρ = 0,43 г/мл, для ИНЗ-600 ρ = 0,40 г/мл.

Газ-носитель (подвижная фаза). В качестве газа-носителя используют водород, азот, аргон и диоксид углерода, нерастворимые или весьма слаборастворимые в неподвижной фазе. Выбор газа в первую очередь определяется типом используемого детектора. Однако желательно применять газы с малыми вязкостью и коэффициентом диффузии, так как это позволяет работать с минимальным перепадом давления в колонке при оптимальной скорости газа. Снижение коэффициента диффузии газа уменьшает так называемые диффузионные эффекты, выражающиеся в расширении полос компонентов на хроматограмме.

Детекторы. В газожидкостной хроматографии используют различные типы детекторов. В зависимости от метода измерения они разделяются на интегральные и дифференциальные. Интегральные детекторы измеряют суммарное количество вещества, вышедшее из колонки за некоторый промежуток времени. Хроматограмма получается в виде ряда ступеней, каждая из которых соответствует появлению определенного компонента. Высота ступени пропорциональна количеству компонентов в пробе.

Дифференциальные детекторы измеряют мгновенное изменение концентрации вещества в газе-носителе. Так как компоненты пробы выходят из колонки постепенно, появление их записывается в виде кривой Гаусса. Площадь, ограниченная этой линией и основной линией, пропорциональна концентрации компонента. В исследованиях пищевых продуктов чаще всего используют дифференциальные детекторы.

В основу определения состава выходящего из колонки газа в наиболее распространенных детекторах положено измерение его физических свойств: теплопроводности или электропроводности при ионизации газа.

Первоначально наибольшее распространение получили детекторы, измеряющие изменение теплопроводности выходящего газа. Основной частью этих детекторов являются термоэлементы с малым сопротивлением, изготовленные из полупроводника (термистор) либо из платиновой или вольфрамовой проволоки (катарометр). Обычно используют два термоэлемента (один для обнаружения компонентов, другой для сравнения), их включают по типу моста Уитстона.

В мост соединены два сопротивления R₁ и R₂, а также два термоэлемента С₁ и С₂. Сигнал самописца снимается по диагонали моста. Сопротивления R₁ и R₂ подбирают таким образом, чтобы при прохождении чистого газа-носителя через термоэлементы С₁ и С₂ сигнал на самописце S равнялся нулю. Когда через измерительный термоэлемент С₁ проходит газ-носитель с компонентом пробы, баланс моста нарушается, а появившаяся разность потенциалов усиливается и записывается самописцем.

Преимуществами детекторов этого типа являются простота их изготовления и универсальность применения для химических соединений почти любого строения. В зависимости от геометрической конструкции и рабочей температуры с помощью термических детекторов можно определять в газе-носителе до 10^–8…10^–5 молей растворенного вещества. Для достижения максимальной чувствительности в качестве газа-носителя используют водород или гелий, обладающие наибольшей теплопроводностью.

Недостатки термических детекторов – невысокая для некоторых целей чувствительность и большая зависимость сигнала от изменения рабочих параметров опыта. При работе с детекторами этого типа колебание скорости потока газа-носителя не должно превышать 20 мл/ч, температура термостата и детектора должна поддерживаться с точностью не менее ±0,1 °С.

Более чувствительными, получившими наибольшее распространение в последнее время, являются ионизационные детекторы. Существует два вида таких детекторов, различающихся по принципу ионизации: β-иони-зационный (аргоновый) и пламенно-ионизационный детекторы.

β-ионизационный, или аргоновый, детектор состоит из ионизационной камеры, к которой приложено высокое напряжение. Камера содержит источник ионизирующего излучения – Rа, Sr⁹⁰ или Рm¹⁴⁷, с помощью которых возбуждаются атомы аргона. Принцип работы детектора основан на том, что атомы инертных газов (аргона, гелия) способны возбуждаться до метастабильного состояния, в котором они остаются до столкновения с атомами или молекулами органических веществ. Эта энергия возбуждения аргона равна 11,6 эВ, она выше потенциала ионизации большинства молекул. Поэтому возбужденные атомы аргона, сталкиваясь с атомами органических соединений, элюированных из колонки, ионизируют их. Ток ионизации регистрируется обычными методами. В широком диапазоне концентраций наблюдается линейная зависимость между сигналом детектора и содержанием органических веществ. Чувствительность аргонового детектора достигает 10^–15…10^–14 молей. Используемый аргон должен быть очень высокой чистоты.

Принцип действия пламенно-ионизационного детектора основан на том, что при сжигании в пламени водорода молекулы ионизируются. Сила ионного тока пропорциональна концентрации молекул, поступающих в пламя. Ионизационный ток самого водорода и газов, используемых в качестве подвижной фазы, практически равен нулю и зависит только от чистоты используемых газов. Чувствительность детектора к углеводородным соединениям зависит от числа атомов углерода в молекуле и выражается формулой

С = , (9.7)

где П – число углеродных атомов в молекуле; М – молекулярная масса.

В пламенно-ионизационных детекторах в качестве газа-носителя мож-но использовать чистый водород или примешивать его к любому газу-носителю на выходе из колонки. Детектор нечувствителен к небольшим колебаниям скорости потока газа-носителя и горючих газов. Он не может регистрировать пары и газы, такие, как воздух, диоксид углерода, пары воды, аммиак и сероводород. Чувствительность его меньше, чем у аргонового детектора, но значительно выше, чем у катарометров, и составляет 10^–10…10^–9 молей. Скорости потоков горючих газов и газа-носителя определяются конструкцией детектора.

Величина пробы и способы ее введения. Необходимая величина пробы определяется прежде всего чувствительностью детектора. При использовании катарометров проба достигает 50 мкл, ионизационных детекторов – не превышает нескольких микролитров.

Для получения более узких пиков на хроматограмме необходимо, чтобы введенная проба была сконцентрирована в минимальном объеме колонки. Поэтому при работе с жидкими веществами необходим допол-нительный подогрев дозатора (на 50…100 °С выше температуры колонки) для мгновенного испарения введенной пробы. Наиболее удобно вводить жидкие пробы медицинским шприцем.

Идентификация компонентов смеси. Качественный состав исследуемой смеси можно установить, сравнивая удерживаемые объемы компонентов смеси с удерживаемыми объемами индивидуальных веществ – «свидетелей». Однако удерживаемые объемы зависят от температуры и давления в колонке, свойств неподвижной фазы, плотности заполнения колонки и т. п., поэтому для правильной идентификации нужно строго придерживаться выбранных условий опыта.

В серийных анализах образцов с известным составом для идентификации достаточно сравнить полученные удерживаемые объемы с удерживаемыми объемами, определенными при предыдущих анализах, если хроматографирование проводилось при тех же условиях опыта.

Для случая неизвестного качественного состава смеси существует несколько методов идентификации веществ:

предварительное введение вещества, наличие которого предполага-ется;

построение логарифмической зависимости удерживаемого объема от числа углеродных атомов в цепи;

выделение компонента и его идентификация

и др.

При первом методе хроматографируют смесь анализируемой пробы с чистым веществом, наличие которого предполагается. При подтверждении предположения на хроматограмме наблюдают прирост пика. Если соединения не идентичны, появится новый пик (или перегиб на первоначальном пике). Обычно хроматографируют смесь на нескольких жидких фазах разной полярности, так как некоторые компоненты смеси могут иметь на одной жидкой фазе одинаковые удерживаемые объемы.

Второй метод основан на существовании в пределах одного гомологического ряда линейной зависимости логарифма удерживаемого объема от числа углеродных атомов.

Третий метод заключается в выделении соответствующей фракции в охлаждаемой ловушке после детектора и последующей идентификации выделенного вещества физическими и химическими методами.

Качественное определение компонентов. При количественной интерпретации данных, полученных с помощью дифференциальных детекторов, необходимо учитывать систему детектирования. В большинстве систем сигнал зависит от природы фиксируемого вещества. К этому типу детекторов относится катарометр. Его показания зависят не только от количества, но и от свойств компонентов. Поэтому в общем случае для получения максимальной точности необходимо проводить калибровку сигнала катарометра. Однако при использовании в качестве газа-носителя водорода или гелия, а также при анализе высокомолекулярных веществ, близких по своей природе, калибровкой можно пренебречь.

В ионизационных детекторах сигнал в определенных пределах не зависит от природы компонентов или может быть заранее рассчитан на основании их строения. Количественная интерпретация дифференциальных хроматограмм основана на изменении высоты или площади пика. Высота пика очень чувствительна к колебаниям рабочих условий, особенно температуры. Площадь пика чувствительна в основном только к изменению скорости потока. Существует ряд способов определения площади пика, но в последнее время чаще всего пользуются интегратором, находящимся в вычислительной машине, которая входит в комплект хроматографа.

Принимая сумму площадей всех пиков за 100 %, вычисляют содержание каждого компонента в процентах по формуле

С_n = 100 , (9.8)

где С_п – мольная доля п-го компонента; S_п – площадь пика п-го компонента; ΣS_п – сумма площадей пиков всех компонентов.

Этот метод можно уточнить, вводя калибровочные коэффициенты К_i, учитывающие природу отдельных компонентов. Тогда концентрация п-го компонента может быть вычислена по формуле

С_n = 100 . (9.9)

Калибровочные коэффициенты вычисляют на основании анализа ряда искусственных смесей, близких по составу к исследуемым.

Другой метод количественной оценки хроматограмм – внутренняя калибровка. К исследуемой смеси добавляют определенное количество стандартного вещества (лучше отсутствующего в смеси), пик которого находится вблизи пиков анализируемых компонентов. Концентрацию вычисляют, сравнивая площади пиков исследуемых компонентов с площадью пика стандартного вещества, введенного в известной концентрации.