9.1. Адсорбционная молекулярная хроматография
Адсорбционная хроматография основана на различии в адсорбируемости веществ. В данном случае в процессе хроматографирования происходит непрерывная смена сорбции и десорбции молекул растворенного вещества на поверхности твердой дисперсной фазы.
Сущность адсорбционного метода разделения заключается в пропускании раствора исследуемой смеси через колонку, заполненную твердым сорбентом. Вследствие различия в адсорбционной способности отдельных компонентов происходит их разделение. При этом наиболее сильно адсорбирующиеся компоненты удерживаются в верхней части колонки, а компоненты меньшей адсорбционной способности располагаются в виде ряда последующих полос по высоте адсорбента. Пропуская затем через слой адсорбента чистый растворитель, можно добиться четкого пространственного разделения компонентов, которые выделяют из колонки с помощью нескольких различных приемов. Адсорбционная способность вещества зависит от его химического состава, природы и строения, а также от физических и химических свойств адсорбента.
Принцип адсорбционной хроматографии используется, например, при групповом анализе фосфатидов, при определении токоферолов и во многих других случаях.
Рассмотрим в качестве примера разделение липидов на отдельные компоненты.
В стеклянную колонку диаметром 2 см помещают 13 г силикагеля с величиной зерен 100 меш. При этом высота слоя составляет 7 см. Колонку промывают последовательно 40 мл абсолютного метанола, 40 мл ацетона, 40 мл безводного, очищенного от перекисей диэтилового эфира и 40 мл петролейного эфира. В верхнюю часть колонки вносят 50 мг липидов, растворенных в небольшом количестве петролейного эфира, и элюируют (экстрагируют) отдельные группы липидов порциями по 200…300 мл каждым из растворителей в определенной последовательности: стериды – 1 %-м раствором диэтилового эфира в петролейном эфире; триглицериды – 4 %-м раствором диэтилового эфира в петролейном эфире; стеролы – 10 %-м раствором диэтилового эфира в петролейном эфире; жирные кислоты – 50 %-м раствором диэтилового эфира в петролейном эфире; фосфатиды – 25 %-м раствором метанола в диэтилового эфире и затем 100 мл метанола.
9.2. Распределительная хроматография
В основу распределительной хроматографии положено различие коэффициентов распределения компонентов между двумя несмешивающимися жидкими фазами, из которых одна неподвижно удерживается сорбционными силами на поверхности твердого носителя фазы, а другая непрерывно протекает через носитель и называется подвижной.
Сущность разделения веществ этим методом заключается в том, что на носитель с неподвижной фазой помещают раствор исследуемой смеси и пропускают через него подвижный растворитель. При соприкосновении двух жидких фаз вещество начинает переходить из неподвижной фазы в подвижную до тех пор, пока отношение концентрации веществ в обеих фазах не достигнет строго определенного значения.
Распределительная хроматография в процессе анализа пищевых продуктов применяется в форме хроматографии на бумаге, колоночной и газо-жидкостной.
9.2.1. Хроматография на бумаге
Хроматография на бумаге отличается простотой, несложностью аппаратуры, возможностью использования макроколичества анализируемого вещества и универсальностью, так как позволяет производить качественный и количественный анализ самых разнообразных органических и неорганических веществ.
Процесс разделения смеси веществ на бумаге основан на различии коэффициентов распределения веществ между двумя несмешивающимися жидкостями: подвижной и неподвижной.
В качестве носителя неподвижной фазы служит специальная хроматографическая бумага, изготавливаемая с учетом определенных требований. Хроматографическая бумага должна быть равномерно плотной и не содержать экстрактивных веществ, вымываемых растворителями. По скорости капиллярного поднятия бумага бывает марки «Б» (быстрая) и марки «М» (медленная). Для очистки бумаги от примесей ее перед употреблением промывают обычно соляной или уксусной кислотой.
При хроматографировании на полоску бумаги, пропитанную неподвижным растворителем, наносят в виде пятна раствор анализируемой смеси и опускают в подвижный растворитель. Продвигаясь по бумаге под действием капиллярных сил, подвижная фаза увлекает за собой компоненты смеси, которые в соответствии со своим коэффициентом распределения располагаются по бумаге в виде отдельных пятен.
Процесс хроматографирования проводят в сосудах различных форм и размеров. Можно применять специальные камеры для хроматографии, аквариумы, цилиндры и др. Основным материалом для камер и других аппаратов служит стекло, так как оно позволяет наблюдать за продвижением подвижного растворителя по бумаге. Непременными условиями для всех сосудов являются тщательная их герметизация и насыщение атмосферы камеры парами всех компонентов системы растворителей.
Согласно принятой терминологии процесс разделения смеси веществ протекающим растворителем называется проявлением или развитием хроматограммы, а используемый для этой цели растворитель или смесь растворителей – проявителем. Распознавание веществ на проявленной хроматограмме называется идентификацией. Наиболее распространенный способ идентификации – окрашивание пятен, разделенных специфическими реагентами, или элюирование (экстрагирование) пятен соответствующими растворителями. Окрашенные пятна позволяют расшифровать хроматограмму качественно и количественно (рис. 9.1).
Рис. 9.1. Распределение компонентов смеси на бумажной хроматограмме. Определение параметра Rf.
Главной характеристикой для идентификации окрашенных пятен на бумажной хроматограмме является параметр Rf, вычисляемый по формуле
Rf = а / е,
где а – расстояние от места нанесения смеси (линии старта) до центра пятна определенного компонента; е – расстояние от линии старта до линии фронта растворителя.
Таким образом, параметр Rf есть отношение скорости движения данного компонента к скорости движения растворителя. Так же как и коэффициент распределения, данный параметр для каждого вещества является величиной постоянной, характеризующей порядок расположения компонентов исследуемой смеси на хроматограмме и полноту их разделения при данных условиях анализа: определенной системе растворителей, температуре, марке бумаги, насыщении атмосферы камеры и т. д.
Расшифровку хроматограммы производят сравнением значений полученных значений Rf со значениями Rf «свидетелей» – стандартных смесей, составленных из индивидуальных, достаточно чистых веществ такой же химической природы, как и анализируемая проба. «Свидетели» наносятся на ту же полоску бумаги, что и исследуемая проба, так как величина Rf, как сказано выше, зависит от многих факторов и воспроизводимые значения Rf можно получить только при строгом соблюдении принятых условий анализа.
Количественный состав смеси, разделенной на бумаге, можно установить методами фотометрии, колориметрии, радиометрии и др. Для фотометрии используют или непосредственно пятна на бумаге, или элюаты веществ из этих пятен. В последнем случае пятна вырезают из бумаги, соответствующим растворителем элюируют вещества из каждого пятна и фотометрируют элюаты на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при определенной длине волны. Таким способом определяют, например, аминокислотный состав белков семян, углеводы и др. Жирнокислотный состав жиров и масел определяют фотометрированием пятен жирных кислот непосредственно на бумажной хроматограмме.
При фотометрировании бумажной хроматограммы измеряют интегральную оптическую плотность пятна и получают кривую распределения, описывающую зависимость оптической плотности от интенсивности окраски и размеров пятна. В свою очередь, интенсивность окраски пропорциональна концентрации компонента в пятне.
Для выполнения хроматографии на бумаге существует несколько вариантов метода.
Нисходящая хроматография – полоску бумаги с нанесенными на нее пробами вносят в хроматографическую камеру и помещают верхним концом в лоток с подвижным растворителем, который постепенно протекает по бумаге вниз.
Восходящая хроматография – полоску бумаги с нанесенными пробами свертывают в цилиндр, скрепляют края зажимами или сшивают нитками и опускают в камеру, на дно которой налит подвижный растворитель. Бумагу устанавливают таким образом, чтобы она находилась в камере в строго вертикальном положении. Под действием капиллярных сил подвижный растворитель поднимается по бумаге вверх.
Восходяще-нисходящая хроматография – полоску бумаги с нанесенными пробами одним концом погружают в растворитель, другой перебрасывают через стеклянную палочку. Подвижный растворитель капиллярными силами поднимается по бумаге, перетекает через палочку и спускается вниз.
Горизонтальная хроматография – наиболее простой способ. Полоску бумаги натягивают горизонтально на рамку из стеклянных палочек, которая вставлена в стеклянную кювету. Пробы наносят по обе стороны от середины полоски. Подвижный растворитель поступает по бумажному фитилю из ванночки, расположенной в середине камеры.
Круговая хроматография – из хроматографической бумаги вырезают круг; в нем, в свою очередь, вырезают полоску от края к центру шириной 2 мм, отгибают ее перпендикулярно плоскости круга ко дну сосуда, на который положен круг, и укорачивают круг до нужного размера. Через эту полоску-фильтр всасывается подвижный растворитель, находящийся в сосуде.
Камерами для кругового разделения могут служить две (нижняя и верхняя) сложенные вместе половинки чашки Петри, между которыми натягивают кружок бумаги. Для разделения более сложных смесей пользуются эксикаторами, вкладывая бумагу между крышкой и основанием. Обычно пробу наносят в центр кружка и после проявления получают концентрические кольца. Можно наносить несколько проб по окружности диаметром 2…3 см, а растворитель подводить в центр окружности.
Выбор того или иного способа зависит от назначения анализа и свойств разделяемых веществ. Способ нисходящей хроматографии эффективнее, чем восходящей, так как при восходящем разделении капиллярным силам противодействуют силы земного притяжения. Поэтому при достижении растворителем высоты подъема 20 см скорость его дальнейшего продвижения резко снижается. Однако достоинствами восходящего способа разделения являются применение более простой аппаратуры и точность результатов.
Способ круговой хроматографии применяется для качественного разделения веществ с близкими значениями Rf, так как он в некоторых случаях дает резко разграниченные круговые зоны. Преимуществом кругового способа является также быстрота проведения разделения. Так, на бумажном диске диаметром 6 см проявление происходит в течение 10…15 мин.