9.3. Методики исследований

Метод определения количества летучих жирных кислот

Сущность метода

Метод основан на выделении летучих жирных кислот, накопившихся в мясе при его хранении, и определении их количества титрованием дистиллята гидроокисью калия.

Проведение анализа

Анализ проводят на приборе для перегонки водяным паром (см. рис.22). Навеску измельченного мяса массой 25⁺0,01 г помещают в круглодонную колбу (1). Туда же приливают 150 мл 2%-ного раствора серной кислоты. Содержимое перемешивают и закрывают пробкой (2). Под холодильник (3) подставляют коническую колбу (4) вместимостью 250 мл, на которой отмечают объем 200 мл.

Рис. 22 Прибор для перегонки

Дистиллированную воду в плоскодонной колбе (5) доводят до кипения и паром отгоняют летучие жирные кислоты до тех пор, пока в колбе не соберется 200 мл дистиллята. Во время отгона колбу отгона (1) с навеской подогревают. Титрование всего объема дистиллята проводят 0,1 н. раствором гидроокиси калия (или натрия) в колбе (4) с индикатором (фенолфталеином) до появления неисчезающей малиновой окраски. Параллельно, при тех же условиях, проводят контрольный анализ для определения расхода щелочи на титрование с реактивом без мяса.

Обработка результатов

Количество летучих жирных кислот (Х) в миллиграммах гидроокиси калия на 100 г мяса вычисляют по формуле:

(v- v₀) К _* 5,61 _* 100

Х= ——————————,

т

где v– количество 0,1 н. раствора гидроокиси калия, израс-

ходованное на титрование 200 мл дистиллята из мяса,

мл;

v₀– количество 0,1 н. раствора гидроокиси калия, израс-

ходованное на титрование 200 мл дистиллята кон-

трольного анализа, мл;

К– поправка к титру 0,2 н. раствора гидроокиси калия;

5,61– количество гидроокиси калия, содержащегося в 1 мл

0,1 н. раствора, мг;

т– масса пробы, г.

За результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.

Мясо считается свежим, если в нем содержится летучих жирных кислот до 4 мг гидроокиси калия, сомнительной свежести – от 4 до 9, а выше 9 мг – несвежим.

Мясо птицы: свежее – до 4,5, сомнительной свежести – от 4,5 до 9 мг гидроокиси калия.

Мясо кроликов: свежее – до 2,25 в свежем и до 4,5 в мороженом, сомнительной свежести – 2,25–9 и 4,5–13,5 мг КОН соответственно.

Метод определения продуктов первичного распада

белков в бульоне

Сущность метода

Метод основан на осаждении белков нагреванием, образовании в фильтрате комплексов сернокислой меди с продуктами первичного распада белков, выпадающих в осадок.

Проведение анализа

Вначале готовят бульон. Для этого в колбу помещают 20 г мелко измельченного ножницами мяса и заливают 60 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы перемешивают, закрывают часовым стеклом и нагревают до кипения. Можно использовать бульон, приготовленный для определения его аромата и прозрачности. Горячий бульон фильтруют через плотный слой ваты толщиной не менее 0,5 см в пробирку и охлаждают. Наливают в пробирку 2 мл фильтрата и добавляют 3 капли 5%-ного раствора сернокислой меди. Пробирку встряхивают два-три раза и ставят в штатив. Через 5 минут отмечают результаты анализа.

Обработка результатов

Мясо считается свежим, если при добавлении раствора сернокислой меди бульон остается прозрачным,

сомнительной свежести – помутнение бульона, а в бульоне из размороженного мяса – интенсивное помутнение с образованием хлопьев,

несвежим – образуется желеобразный осадок, а в бульоне из размороженного мяса – наличие крупных хлопьев.

Метод определения аммиака и солей аммония

Сущность метода

Метод основан на способности аммиака и солей аммония образовывать с реактивом Несслера йодид меркураммония – вещество желто-бурого цвета.

Проведение анализа

Вначале готовят вытяжку. Для этого мясо измельчают ножницами, берут навеску массой 5 г и помещают в колбу с 20 мл дистиллированной воды и настаивают в течении 15 минут периодически взбалтывая, затем фильтруют. Вытяжку готовят для каждого образца отдельно.

Для приготовления реактива Несслера 10 г йодистого калия растворяют в 10 мл горячей дистиллированной воды, добавляют горячий насыщенный раствор хлорной ртути до появления красного осадка. Затем фильтруют и добавляют 30 г гидрата окиси калия, растворенного в 80 мл дистиллированной воды, и 1-5 мл горячего насыщенного раствора хлорной ртути. После охлаждения в раствор добавляют дистиллированную воду до объема 200 мл. Реактив хранят в холодном месте в темной склянке с притертой пробкой.

В пробирку пипеткой вносят 1 мл вытяжки, добавляют 10 капель реактива Несслера. Содержимое пробирки взбалтывают и наблюдают изменение цвета и прозрачность вытяжки.

Оценка результатов

Мясо считается свежим, если вытяжка приобретает зеленовато-желтый цвет с сохранением прозрачности или слегка мутнеет,

сомнительной свежести – интенсивно-желтый цвет иногда с оранжевым оттенком; значительное помутнение с выпадением тонкого слоя осадка после отстаивания в течение 10-20 мин.,

несвежее – желтовато-оранжевое окрашивание; наблюдается быстрое образование крупных хлопьев, выпадающих в осадок.

Метод определения пероксидазы

Сущность метода

Метод основан на способности пероксидазы в присутствии перекиси водорода окислять бензидин и окрашивать раствор в сине-зеленый цвет.

Проведение анализа

Вначале готовят вытяжку. Для этого навеску измельченного мяса массой 20 г переносят в колбу с 80 мл дистиллированной воды и настаивают в течении 15 минут периодически взбалтывая, затем фильтруют.

В пробирку пипеткой вносят 2 мл вытяжки, добавляют 5 капель 0,2%-ного раствора бензидина, содержимое пробирки встряхивают, после чего добавляют 2 капли 1%-ного раствора перекиси водорода и наблюдают окрашивание вытяжки.

Оценка результатов

Мясо считается свежим, если вытяжка приобретает сине-зеленый цвет, переходящий в течении 1-2 минут в буро-коричневый,

несвежим – если вытяжка не приобретает сине-зеленого окрашивания, либо сразу появляется буро-коричневый.

Метод определения кислотного числа жира

Сущность метода

Метод основан на растворении жира смесью диэтилового эфира и этилового спирта 96⁰и титрованием свободных жирных кислот раствором гидрата окиси калия.

Проведение анализа

Берут 20 г внутренней жировой ткани от каждого образца отдельно, измельчают ее ножницами и вытапливают в фарфоровых чашках на водяной бане, фильтруют в химические стаканы через четыре слоя марли и охлаждают до 20^оС.

Навеску жира массой 1 г взвешивают с погрешностью не более 0,001 г, добавляют 20 мл нейтральной смеси этилового эфира и этилового спирта 96⁰(2:1), содержащей 5 капель 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое колбы тщательно взбалтывают до полного растворения жира. После охлаждения до температуры 20⁰С раствор, постоянно взбалтывая, быстро титруют 0,1 н. водным раствором гидрата окиси калия до появления малиновой окраски, не исчезающей в течении 1 мин.

Обработка результатов

Кислотное число жира (Х₁) выражают в миллиграммах гидрата окиси калия, израсходованного на нейтрализацию свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира, и вычисляют по формуле:

v _* K _* 5,61

Х₁=———————,

т

где v– количество 0,1 н. раствора гидрата окиси калия,

израсходованное на титрование, мл;

К– поправка к титру 0,1 н. раствора гидрата окиси калия;

5,61 – количество гидрата окиси калия, содержащегося в 1

мл 0,1 н. раствора, мг;

т – масса жира, г.

Жир от охлажденных и мороженных тушек всех видов птицы с кислотным числом 1,0–2,5 мг КОН считают свежим;

куриный жир от охлажденных тушек с кислотным числом 1,0–2,5 мг КОН, гусиный – 1,0–1,6 мг КОН, утиный и индюшиный – 1,0–3,0 мг КОН, а также жир от мороженных тушек всех видов птицы с кислотным числом 1,0–1,6 мг КОН считают сомнительной свежести.

Метод определения перекисного числа жира

Сущность метода

Метод основан на обработке жира смесью уксусной кислоты и хлороформа раствором йодистого калия и титровании свободного йода раствором серноватистокислого натрия.

Проведение анализа

Навеску жира, приготовленную как для определения кислотного числа жира, массой 0,5 г взвешивают в конической колбе и растворяют в 10 мл смеси ледяной уксусной кислоты и хлороформа (1:1). К раствору добавляют 1 мл свежеприготовленного насыщенного раствора йодистого калия и выдерживают в темном месте в течение 5 мин. Затем в раствор добавляют 30 мл дистиллированной воды. Выделившийся йод оттитровывают 0,002 н. раствором серноватистокислого натрия в присутствии индикатора – крахмала, до исчезновения синей окраски.

Параллельно при тех же условиях проводят контрольный опыт, в котором берут те же количества реактивов, но без жира. Если результат контрольного опыта превышает 0,05 мл раствора 0,01 н. серноватокислого натрия, то следует приготовить свежие реактивы.

Обработка результатов

Перекисное число жира (Х₂) в процентах вычисляют по формуле:

К _* (v- v₁)_*0,0002538_* 100

Х₂= ——————————————-,

т

где К – поправка к титру 0,002 н. раствора серноватистоки-

слого натрия;

v – количество 0,002 н. раствора серноватистокислого

натрия, израсходованное на титрование испытуемого

раствора, мл;

v₁– количество 0,002 н. раствора серноватистокислого

натрия, израсходованное на титрование контрольного

раствора, мл;

0,0002538 – количество йода, соответствующее 1 мл 0,002 н.

раствора серноватистокислого натрия, г;

т– масса жира, г.

Жир от охлажденных и мороженных тушек всех видов птицы считают свежим, если значение перекисного числа жира не превышает 0,001 % йода;

куриный жир от охлажденных тушек с перекисным числом 0,01–0,04% йода, гусиный, утиный, индюшиный – 0,01–0.1% йода, жир от мороженных тушек всех видов птицы с перекисным числом 0,01–0,03 % йода считают сомнительной свежести.

Метод микроскопического анализа

Сущность метода

Метод основан на определении количества бактерий и степени распада мышечной ткани путем микроскопирования мазков-отпечатков.

Проведение анализа

Поверхность исследуемых мышц стерилизуют раскаленным шпателем или обжигают тампоном, смоченным в спирте, вырезают стерильными ножницами кусочки размером 2,0х1,5х2,5 см, поверхностями срезов прикладывают к предметному стеклу (по три отпечатка на двух предметных стеклах). Препараты высушивают на воздухе, фиксируют, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Исследуют на одном предметном стекле 25 полей зрения, подсчитывают в отдельности количество кокковых и палочкообразных микроорганизмов в каждом поле зрения микроскопа и определяют их среднеарифметическое количество в одном поле зрения.

Обработка результатов

Мясо считается свежим, если в мазках-отпечатках не обнаружена микрофлора или в поле зрения препарата видны единичные (до 10 клеток) кокки и палочковидные бактерии и нет следов распада мышечной ткани. Препарат-отпечаток окрашен плохо.

сомнительной свежести – не более 30 кокков и палочек, следы распада мышечной ткани: ядра мышечных волокон в состоянии распада, исчерченность волокон слабо различима,

несвежее – свыше 30 кокков и палочек, значительный распад тканей: полное исчезновение ядер и полное исчезновение исчерченности мышечных волокон. Препарат-отпечаток окрашен сильно.

Метод гистологического анализа

Метод гистологического анализа регламентирован для определения степени свежести мяса всех видов убойных животных, степени его созревания, пригодности к длительному хранению и транспортированию, а также для определения качества мяса при разногласиях, возникающих в его оценке. (ГОСТ 19496-93 “Мясо. Метод гистологического анализа”)

Отбор образцов. От исследуемой мясной туши или ее части острым ножом вырезают образец мяса кубической формы размером 30х30х30 мм. Образец мяса вырезают в направлении перпендикулярном к поверхности туши в глубь мышц так, чтобы одна из сторон образца являлась наружной поверхностью туши или ее части, а другая – поверхностью разруба или распила.

Образец вырезают из мест, наиболее быстро подвергающихся порче, не нарушая товарного вида туши:

-из шейной части, включая зарез;

-у мест разруба грудной кости – из глубокой грудной мышцы

на уровне 4-5-го ребра;

-из мест разруба лонного сращения;

-из других мест туши или ее части, сомнительной по

свежести, по усмотрению ветеринарного врача .

При направлении в лабораторию к каждому образцу при помощи иголки с ниткой прикрепляют этикетку из пергамента, заполненную графитным карандашом, с обозначением: номера туши или ее части, присвоенного при изъятии образца; вида мяса; анатомического названия образца; даты взятия образца.

При отправке в лабораторию, расположенную вне предприятия, все образцы с этикетками помещают в стеклянную банку с 10% водным раствором нейтрального формалина, взятым в десятикратном объеме, для фиксации. Банку с образцами плотно укупоривают и направляют с сопроводительным документом.

Подготовка к анализу. Для приготовления гистологических препаратов из каждого образца вырезают кусочек мяса размером 30х15х4 мм таким образом, чтобы в него вошли поверхность разруба или распила, наружная поверхность туши и все лежащие ниже нее ткани на глубину 30 мм. Мышечные волокна в вырезанном кусочке мяса должны быть расположены параллельно плоскости разреза.

Вырезанные из всех образцов кусочки мяса подвергают быстрой фиксации 10%-ным водным раствором нейтрального формалина. Для этого кусочки мяса, с предварительно прикрепленной пергаментной этикеткой и номером образца помещают в небольшую колбу или широкую пробирку, заливают 4-5 объемами формалина и подогревают, не доводя до кипения, на пламени горелки. При появлении пузырьков воздуха подогрев прекращают, содержимое осторожно встряхивают и снова подогревают до появления пузырьков воздуха. Так повторяют три-четыре раза. После фиксации формалин выливают, в колбочку вставляют стеклянную воронку и промывают кусочки мяса холодной водой в течении 2 минут. Промытые кусочки мяса режут на замораживающем микротоме в плоскости, параллельной оси волокон, получая срезы толщиной 15-30 мкм.

С микротомного ножа с помощью кисточки срезы переносят в небольшой кристаллизатор с водопроводной водой на несколько секунд для распрямления. Под неповрежденный срез быстро подводят предметное стекло для наклеивания, обработанное яичным белком с глицерином (2:1), и извлекают срез из воды, удерживая его на середине стекла препаровальной иглой. Затем срез накрывают сухой фильтровальной бумагой (3-4 слоя) и, прижимая бумагу ребром ладони, наклеивают на предметное стекло.

Наклеенные срезы окрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха в течении 3-4 мин и промывают 2 мин в воде. Для удаления избытка гематоксилина срезы помещают в 1% раствор соляной кислоты (до порозовения), затем в аммиачную воду с целью нейтрализации соляной кислоты (до посинения срезов) с последующей промывкой их в воде в течении 2 мин. Докрашивают срезы 1% водным раствором эозина в течении 1 мин с последующим ополаскиванием в воде. Затем образцы обезвоживают двумя порциями этилового спирта, последовательно погружая их в каждую порцию на 1 мин. Просветляют срезы в карболксилоле и отмывают в кислоте, выдерживая в каждом по 1 мин. Подготовленные срезы заключают в шихтовый или канадский бальзам под покровное стекло.

Для гистологического анализа от каждого образца готовят не менее трех срезов для параллельного анализа.

Исследование гистопрепаратов и оценка степени свежести по микроструктурным показателям. Подготовленные и окрашенные срезы рассматривают под микроскопом сначала при малом увеличении объектива 10^х, затем при среднем – 40^хи в отдельных случаях под иммерсией – 90^х.

Степень свежести определяют по пяти основным микроструктурным показателям:

-по исчезновению корочки подсыхания;

-по интенсивности исчезновения структуры ядер мышечных волокон вследствие лизиса (растворения) и постепенной потере ядрами способности к окраске;

-по интенсивности исчезновения поперечной и продольной исчерченности волокон;

-по постепенной потере мышечными волокнами способности к окраске;

-по глубине распространения порчи и интенсивности размножения микрофлоры в мясе.

В зависимости от микроструктурных показателей образцов мяса относят к одной из степени свежести, указанных в таблице 8.

Таблица 8

Микроструктурные показатели мяса при различной свежести

Наименование	Микроструктурная характеристика
показателя	свежего мяса	свежего мяса, не подлежащего длительному хранению	мяса сомнительной свежести	несвежего мяса
Корочка подсыхания	Плотная, т.е. поверхностный слой соединительной ткани и прилегающие к ней мышечные волокна, а также места разруба – уплотненные	Набухшая, размягченная и разрыхленная	Отсутствует на отдельных участках поверхности мяса, вследствие ослизнения этих участков	Отсутствует; вся поверхность мяса липкая
Состояние структуры ядер мышечных волокон	Структура четко выражена	Структура не различима. Изменение ядер в мышечных волокнах может распространяться на глубину до 3 мм от поверхности мяса	Ядра мышечных волокон в состоянии распада-растворения	Почти полное исчезновение ядер
Состояние поперечной и продольной исчерченности мышечных волокон	Исчерченность ясно и четко выражена	Исчерченность ясно и четко выражена	Исчерченность слабо различима. Изменение в мышечных волокнах распространяется на глубину до 15 мм от поверхности мяса	Полное исчезновение исчерченности.Границы волокон различимы по сильно набухшему утолщению сохранившемуся эндомезию. Изменения в мышечных волокнах распространяются на глубину до 30 мм и больше от поверхности мяса
Способность ядер и мышечных волокон к окраске	Хорошая, равномерная	Хорошая, равномерная	Ядра мышечных волокон неравномерно и слабо окрашены.	Отсутствует или едва различима
Размножение микрофлоры и границы ее распространения	На поверхности разруба и в рыхлой соединительной ткани поверхностных фасций могут встречаться отдельные очажки кокковой микрофлоры	На поверхности разруба и в рыхлой соединительной ткани поверхностных фасций наличие кокковой и палочковидной микрофлоры в виде множественных очажков и диффузных наложений, распространившихся на глубину до 3 мм от поверхности мяса	На поверхности разруба и в рыхлой соединительной ткани поверхностных фасций наличие кокковой и палочковидной микрофлоры в виде множественных очажков и диффузных наложений, распространившихся на глубину до 5 мм от поверхности мяса	На всей поверхности разруба и в рыхлой соединительной ткани поверхностных фасций диффузные наложения преимущественно палочковидной микрофлоры, распространившейся на глубину до 10 мм от поверхности мяса