Добавил:
ivanov666
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Сборник трудов областной научной конференции Молодые ученые – Кузбассу. Взгляд в XXI век. Медико-биологические науки
.pdf
"Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
221
применение в качестве гаптена пусть и неканцерогенного аналога ПАУ
нежелательно, поскольку данные вещества абсолютно чужеродны для
организма. Можно, однако, использовать другой подход – применить при
вакцинации вместо гаптена его «внутренний образ» - антиидиотипические
антитела (ААТ).
Если допустить возможным использование для иммунизации
человека МААТ, то остается пока открытым вопрос о том, чей внутренний
образ они должны нести. Желательно, чтобы АТ, образующиеся в ответ на
введение вакцины, реагировали с максимально широким спектром
канцерогенов. Кроме того, знание общих закономерностей формирования
перекрестной реактивности АТ, индуцируемых отдельными родственными
соединениями, позволило бы выбрать наиболее адекватные гаптены для
иммунизации и иммуноанализа АТ, поскольку использование для этих
целей множества препаратов на основе различных гаптенов сложно и
дорого.
Наиболее адекватным подходом к исследованию перекрестной
реактивности АТ, индуцированных ПАУ, мы считаем изучение
поликлональных АТ, полученных у животных после иммунизации
различными ПАУ и очищенных на аффинных сорбентах, также
содержащих ПАУ. Полученные при этом моноспецифические АТ к ПАУ
можно будет использовать для получения и отбора МААТ заданной
специфичности и аффинности. Для более точного определения
аффинности планируется использовать радиоиммунный анализ (РИА) с
использованием меченых моновалентных конъюгатов ПАУолигонуклеотид.
Исходя из изложенного нами предполагаются следующие этапы в
работе, направленной на создание МААТ-вакцины против ПАУ.
•
Синтез конъюгатов носитель-гаптен для ряда ПАУ (антрацен,
бензантрацен, пирен, бензпирен, хризен);
•
Получение антисывороток против этих конъюгатов;
•
Разработка системы иммуноанализа АТ к ПАУ;
•
Синтез аффинных сорбентов, содержащих те же гаптены;
•
Выделение из антисывороток поликлональных моноспецифических АТ
против гаптенов;
•
Изучение перекрестного реагирования АТ, полученных при
иммунизации ПАУ, с другими представителями этой химической
группы;
•
Разработка модельной системы иммуноанализа антиидиотипов ПАУ;
•
Получение МААТ, несущих заданный внутренний образ ПАУ.
222 "Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
Очевидное отсутствие иммуногенных свойств у ПАУ, подразумевает
необходимость получения конъюгатов этих соединений с
высокомолекулярными носителями для проведения иммунохимических
исследований.
В силу выраженной химической инертности и гидрофобности ПАУ,
их необходимо активировать введением какой либо химически активной
группой перед ковалентным связыванием с белком-носителем. В
опубликованных работах разных групп исследователей были описаны
различные методы конъюгации ПАУ-белок, в том числе и для получения
конъюгатов В[a]Р-белок.
Анализируя достоинства и недостатки известных способов синтеза и
свойства конъюгатов ПАУ-белок, в своей работе мы стремились к
следующему:
1. процедура введения активной группы в ПАУ должна быть максимально
простой;
2. активированный ПАУ должен сохранять стабильность при хранении;
3. активная группа в ПАУ должна обладать высокой реакционной
способностью;
4. конъюгация ПАУ с белком должна осуществляться в одну стадию,
спонтанно, без использования дополнительных реагентов;
5. процедура удаления из конъюгата несвязавшегося ПАУ должна быть
технически простой, позволяющей очищать одновременно большие
количества конъюгата;
6. конъюгат должен обладать хорошей растворимостью в
физиологических растворах и не содержать фракции полимерных
продуктов (пересшитых белков) для выполнения различных вариантов
иммуноанализа АТ к ПАУ;
7. конъюгат не должен содержать ковалентно несвязанного гаптена, иначе
свободный ПАУ будет индуцировать опухоль в месте иммунизации;
8. ковалентная связь ПАУ-белок должна быть устойчива к действию
протеолитических ферментов организма, особенно в местe иммунизации,
так как отщепление гаптена от носителя лишит его иммуногенности;
9. желательно наличие дополнительной группы (спейсера) между ПАУ и
белком для лучшего представления РАН лимфоцитам при иммунизации и
АТ при иммуноанализе;
10. конъюгат должен быть устойчивым при хранении в растворе и в
лиофизированном виде.
Из всего многообразия методов конъюгации низкомолекулярных
соединений с белками, как наиболее удовлетворяющий перечисленным
выше условиям, нами был применен способ ковалентного связывания
"Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
223
гаптена с белком, заключающийся в образовании азометиновой связи
между альдегидной группой гаптена и ε-аминогруппами лизина в белке.
Выбор альдегидной группы для активации гаптена обусловлен ее высокой
реакционной способностью, широкими синтетическими возможностями ее
модификации, а также легкостью ее введения в ароматическую систему
при формилировании полициклических соединений. Ранее альдегиды ПАУ
для получения конъюгатов с макромолекулярными носителями не
применялись.
Синтез конъюгатов ПАУ с БСА проводили при реакции
соответствующего альдегида с БСА в щелочном водно-пиридиновом или
водно-диоксановом растворе с последующим восстановлением
азометиновых связей боргидридом натрия. Без восстановления
азометиновых связей конъюгат полностью гидролизуется в нейтральной
среде за несколько часов.
Однако стабилизация конъюгата восстановлением азометиновых
связей приводит к одновременному восстановлению внутримолекулярных
дисульфидных связей в белках с образованием тиоловых групп, что
затрудняет последующую очистку и исключает использование конъюгата в
иммуноанализе. Так, осаждение конъюгата ацетоном с последующим
отмыванием непрореагировавшего гаптена органическим растворителем
приводит к образованию нерастворимой формы конъюгата. Использование
диализа или гель-фильтрации в данном случае нами не представляется
целесообразным из-за удерживания некоторого количества несвязанного
гаптена (до 0.2 мг на 100 мг белка по нашим исследованиям) в
гидрофобных областях белка. Предотвратить образование нерастворимых
полимерных продуктов за счет окисления тиоловых групп с образованием
межмолекулярных дисульфидных связей удалось использованием
блокирующего соединения на стадии стабилизации конъюгата, т.е.
соединения, способного необратимо реагировать с тиоловыми группами
белка. Число таких соединений обширно и хорошо известно. Это могут
быть соединения различных классов: производные иодуксусной и
акриловой кислот, непредельные производные гетероциклических
соединений, циклические имины, оксираны. Добавка акриламида на
стадии стабилизации позволила снизить количество нерастворимой
фракции конъюгата с 85% до 5%.
По разработанной методике были получены конъюгаты B[a]P-6карбальдегида, пирен-1-карбальдегида, фенантрен-9-карбальдегида,
аценафтен-5-карбальдегида, антрацен-9-карбальдегида, 10-метилантрацен9-карбальдегида, бенз[a]антрацен-7-карбальдегида, флуорен-2карбальдегида и хризен-6-карбальдегида с БСА с заданным соотношением
224 "Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
10±1 моль ПАУ на моль белка. Такое молярное соотношение гаптенноситель является оптимальным для получения АТ к гаптену. На
представленный метод выдан патент РФ.
Использование таких конъюгатов при иммунизации животных,
конечно же, вызывает образование АТ не только к гаптену, но и к белку –
носителю. Поэтому для иммуноанализа АТ в гипериммунных сыворотках
или получения афинно очищенных АТ к ПАУ необходимо использовать
другой белок-носитель. Для иммуноанализа мы синтезировали конъюгаты
ПАУ с гексокиназой. Этот же конъюгат был использован и для афинной
очистки АТ после его иммобилизации на бром-циан-сефарозе. В
настоящее время получены поликлональные гипериммунные сыворотки к
БП, БА, антрацену, хризену и пирену и начато исследование перекрестных
реакций АТ к перечисленным ПАУ.
Этот путь получения конъюгата, когда применяются полимерные
носители чисто биологического происхождения или синтезированные из
полипептидов, можно назвать классическим. Но существует и еще один
путь получения иммунного ответа к гаптену или слабому антигену, использование синтетического полиионного носителя. Такое направление
развивается уже более 20 лет работами Р.В. Петрова и Р.М. Хаитова.
Учитывая их исследования, нами проводится синтез конъюгата
ПАУ-поликатионный сополимер. При этом мы основываемся на известных
фактах:
1. полиионный носитель, не обладая иммуногенностью, оказывает
адъювантное действие;
2. иммуностимулирующая активность полиионного носителя не зависит от
тонких особенностей его химического строения;
3. оптимальное строение полиионного носителя - поликатионное с 40%
заряженных звеньев в полимерной цепи.
Водорастворимой основой полимера является N-винилпирролидон.
Катионные звенья в полимере создаются диметилдиаллиламмоний
хлоридом.
Выбор этих мономеров не является случайным. Он обусловлен
отсутствием токсичности у сополимера достаточно редким (если не
уникальным) случаем радикальной сополимеризации, когда состав
сополимера всегда строго соответствует составу исходной смеси
сомономеров. Это особенно важно потому, что позволяет легко
варьировать состав сополимера. Важным является и тот факт, что при
данном соотношении сомономеров чередование звеньев в полимерной
цепи максимально статистично и в полимере отсутствуют участки
блочности, то есть протяженные участки звеньев одного из сомономеров.
"Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
225
Небольшая добавка (до 5%) аллиламина или N-(2аминоэтил)кротиламида позволяет ввести в полимерную цепь активные
амино-группы, по которым проводится модификация полимера. Процесс
модификации полимера заключается в образовании амидной связи между
амино-группой сополимера и карбоксильной группой гаптена под
действием дициклогексилкарбодиимида. Гаптен с карбоксильной группой
получают по реакции соответствующего альдегида ПАУ с
карбоксиметилгидроксиламином.
Модификацию можно провести не только карбодиимидным
способом, но и способом смешанных ангидридов при активации
карбоксильной группы изобутилхлорформиатом. Применение ПАУальдегидов в способе азометиновой модификации полимера дает конъюгат
с более короткой спейсерной группой (3 атома) между гаптеном и
полимерной цепью.
Использование конъюгата поликатионной структуры позволит при
иммунизации добиться отсутствия в антисыворотке антител к носителю.
Необходимо отметить свойство ПАУ, которое широко используется
в экологических исследованиях при мониторинге окружающей среды – это
флуоресценция. Все ПАУ обладают достаточно сильной флуоресценцией,
а особенно бензо(а)пирен, который из-за этого является маркером общего
загрязнения ПАУ.
Применительно к нашим исследованиям это позволяет разработать
иммунофлуоресцентный метод анализа АТ к ПАУ, базирующийся на
измерении гашения или поляризации флуоресценции.
Учитывая отсутствие необходимости введения специальной
флуоресцентной метки и применение для такого анализа гомогенной
методики, дает основу для разработки крайне простого метода
иммунофлуоресцентного анализа, выгодно отличающего его от
традиционных гетерогенных методик иммуноферментного анализа.
Быстрота установления равновесия в гомогенной системе антиген –
антитело (порядка 10 минут) значительно повышает производительность
исследований.
Гидрофобность и нерастворимость ПАУ в воде не позволяет
проводить такой анализ со свободными ПАУ, для этого им надо придать
растворимость в воде. Но введение гидрофильных групп придает им
свойства поверхностно – активных веществ, адсорбции на стенках
приборов и мицеллообразования в растворе. Эти трудности можно
преодолеть, синтезировав водорастворимые сополимеры ПАУ.
Для их получения выбран также сополимер винилпирролидона с
аллиламином или N-(2-аминоэтил)кротиламидом. Для такого сополимера,
226 "Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
содержащего аминогруппы, метод конъюгации тождественен методам
получения поликатионного конъюгата.
Метод иммунофлуоресцентного анализа позволяет очень быстро
определять константы афинности АТ как к собственному антигену
(гаптену), так и к родственным антигенам в перекрестных реакциях.
Легкость определения таких констант может существенно облегчить
скрининг моноклональных АТ на специфичность в гибридомной
технологии.
Исследования с полиионными носителями у нас только начались.
Мы надеемся, что вскоре появятся и первые результаты, которые
подтвердят или опровергнут наши надежды на их использование в
иммунохимии канцерогенеза.
Литература
1. Chagnaud JL, Faiderbe S, Geffard M. Effects of monoclonal anti-idiotypic
antibody, internal image of benzo(a)pyrene on sarcoma in rats. CR Acad Sci
III.-1993.-vol.316(10).-p.1266-1269.
2. Creech H.J., Franks W.R. Compounds synthesized from proteins and
carcinogenic hydrocarbons. Am.J.Cancer.-1937.-vol.30.-p.555-562.
3. Creech H.J., Franks W.R. Chemoantigens and carcinogenesis. Am.J.Cancer.-
1939.-vol.35.-p.203-212.
4. Curtis G.L., Ryan W.L., Stenback F. Antibody stimulation of benzo(a)pyrene
carcinogenesis. Cancer Letters.-1978.-vol.4.-p.223-228.
5. Moolten F.L., Capparell N.J., Boger E. et al. Induction of antibodies
against polycyclic aromatic hydrocarbons. Nature.-1978.-vol.272.-p.614-616.
6. Moolten F.L., Capparell N.J., Boger E. et al. Induction of antibodies against
polycyclic aromatic hydrocarbons. Nature.-1978.-vol.272.-p.614-616.
7. Peck R.M. et al. Inhibition of chemically induced neoplasma by
immunization with an antigenic carcinogen-protein conjugate. Cancer
Research.-1971.-vol.31.1550-1554.
8. Silbart L.K., Nordblom G., Keren D.F. et al. A rapid and sensitive screening
method for the detection of anti-2-acetylaminofluorene immunoglobulins. J.
of Immunol. Methods.-1988.-vol.109.-p.103-112.
9. Silbart L.K., McAleer F., Rasmussen M.V. et al. Selective induction of
mucosal immune responses to 2-acetylaminofluorene. Anticancer Res.-1996.vol.16(2).-p.651-660.
10. Tompa A. et al. Benzo(a)pyrene antibody inhibition of benzo(a)pyrene-
induced mutagenesis. Cancer Letters.-1979.-vol.7.-p.163-169.
"Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
227
М.Г.Чеченин
АНЕСТЕЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНОЙ И
МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИЙ
Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей
Новокузнецкая муниципальная клиническая больница №1
По литературным данным проведение компьютерных и магнитнорезонансных томографий в 3-10% случаев возможно только в условиях
анестезиологического пособия. Задача анестезиолога - обеспечить
безопасную неподвижность пациента во время томографии [1-3].
Отделение лучевой диагностики МКБ №1 г. Новокузнецка имеет 5-летний
опыт проведения томографий с привлечением анестезиологической
бригады [2].
Цель исследования
Повышение безопасности пациентов при компьютерной (КТ) и
магнитно-резонансной томографиях (МРТ) путем оптимизации проведения
анестезиологических пособий при данных видах томографий.
Материалы, методы
В отделении лучевой диагностики МКБ №1 функционируют 2
томографа: рентгеновский – CT MAX-640, и магнитно-резонансный –
Vectra-2 (закрытого типа). Особенности работы анестезиолога при
томографии следующие:
1. Во время проведения магнитно-резонансной томографии (МРТ) нельзя
пользоваться металлическими магнитящимися предметами, в том числе
тонометром, автоматической следящей аппаратурой, наркозным аппаратом
и т. п. [3].
2. Во время проведения МРТ закрытого типа пациент находится в узком
пространстве в форме трубы диаметром 65 см и длиной 170 см. Отдельные
участки тела (голова, верхняя часть туловища при исследовании головного
мозга) находятся за пределами видимости и досягаемости анестезиолога.
3. Работа во время исследования на компьютерном томографе (КТ)
сопровождается рентгеновским облучением [2].
Следует отметить, что томографы отделения изначально не были
укомплектованы каким-либо специальным (напр. амагнитным)
анестезиологическим оборудованием и средствами автоматического
мониторинга.
Анестезиолог отделения оснащен двумя наркозными аппаратами
«Полинаркон-5», а также средствами для внутривенного наркоза.
228 "Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
Результаты исследования и их обсуждение
За 1999–2000 г.г. из 9255 томографических исследований в 557 (в 6%
случаев) потребовалось проведение анестезиологических пособий. В том
числе: 545 наркозов, 10 медикаментозных седаций, 2 случая интенсивной
терапии с интенсивным наблюдением во время томографии.
Пособия оказывали пациентам обоих полов (59,4% мужчин; 40,6%
женщин) в возрасте от 3 дней до 76 лет. В зависимости от возраста
проведение наркоза требовалось с различной частотой. Самому молодому
пациенту, которому была проведена КТ без наркоза, было 2 года 6 мес. Все
дети младше 2 лет 6 месяцев нуждались в наркозе. В более старших
возрастных группах потребность в наркозе была высокой до 7 лет. С 9 лет
и старше потребность в наркозе не отличалась от взрослых (2,78 %). Среди
детей наблюдалась различная потребность в наркозе в зависимости от вида
томографии. В возрастной группе 4-6 лет потребность в наркозе при МРТ
значительно преобладала над КТ.
Показаниями к наркозам были: малый возраст (до 6 лет) 296 случаев;
неадекватность пациента (все виды нарушения сознания) 158; возбуждение
(психическое, моторное) 39; клаустрофобия 33; наличие болевого
синдрома 33. Клаустрофобия при МРТ развивалась чаще, что связано с
«закрытой» конструкцией аппарата.
Из общего числа пособий (557) выполнено: внутривенных наркозов
234; масочных - 97; комбинированных - 201 (в т. ч. масочный
вводный+внутривенный базисный - 194, масочный
вводный+внутримышечный базисный - 7); наркозов с ларингеальной
маской 2; медикаментозных седаций 10; интенсивной терапии и
интенсивного наблюдения 2.
Перед исследованием с пациентами проводилась обязательная
психопрофилактика, благодаря которой 22 % пациентов удалось убедить в
необходимости прохождения томографии без наркоза.
Детям до 6 лет вводный наркоз осуществлялся ингаляционно через
маску. Детям с венозными катетерами проводился внутривенный наркоз.
Вводный масочный наркоз перед МРТ проводили в процедурном кабинете,
затем ребенка доставляли в кабинет МРТ. Базисный наркоз детям до 6 лет
осуществляли 2 способами: масочным (97 наблюдений при КТ),
комбинированным (201 - при КТ и МРТ). Масочный базисный наркоз
проводили только при КТ по причине возможности использования там
наркозного аппарата, причем вводный и базисный проводили
непосредственно на столе КТ.
"Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
229
Следует отметить: проведение масочного наркоза во время КТ
опасно для анестезиолога из-за несовершенства антирадиационной
защиты.
Дети 6-10 лет вводились в наркоз либо внутривенно, либо масочно,
старше 10 лет – внутривенно. Для внутривенных наркозов использовали
различные препараты и их комбинации в дозах, соответствующих
хирургической стадии наркоза. Самой популярной для наркоза детям была
комбинация кетамина и реланиума; взрослым - тиопентал, реже пропофол.
Препараты длительного действия - реланиум и ГОМК – вводились чаще
взрослым и только в начале пособия. Проходимость дыхательных путей в
92% наблюдений достигалась неинвазивно. Использовали пропофолсберегающие методики.
Осложнения пособий
Апноэ, гиповентиляция 4; рвота 3; коллапс гемодинамики 2;
нарушение проходимости верхних дыхательных путей 2; ларингоспазм 2;
психомоторное возбуждение 1. Всего 10 осложнений. Частота
анестезиологических осложнений превышает таковую в
общехирургической сети.
Выводы
1. Анестезиологическое обеспечение требуется в 6% КТ и МРТ.
2. Потребность в наркозах среди детей 4 - 6 лет и среди пациентов с
клаустрофобией выше при МРТ (закрытого типа), чем при КТ.
3. Психопрофилактическая подготовка пациента перед томографией
позволяет снизить частоту наркозов на 22%.
4. Все дети до 2,5 лет нуждаются в наркозе во время проведения КТ и
МРТ. Потребность в наркозе для детей от 3 до 8 лет
обратнопропорциональна возрасту. Пациенты старше 8 лет нуждаются в
наркозе в 2,8% случаев.
5. Высокая частота осложнений (1,8%) при анестезиологических пособиях
во время КТ и МРТ обусловливает необходимость дальнейшего
совершенствования анестезиологического обеспечения при томографиях.
Практические рекомендации
Проходимость дыхательных путей в большинстве случаев (в 92%)
обеспечивается тройным приемом - запрокидыванием головы,
выдвижением нижней челюсти и открыванием рта, с использованием
приспособлений внешней иммобилизации (фиксаторы, валики, распорки,
липкие ленты и т.п.). Надежная фиксация исследуемой части тела
ограничивает непроизвольные движения, предотвращает "смазывание"
230 "Молодые ученые – Кузбассу"
Медико-биологические науки
изображения на томограммах, позволяет снижать глубину наркоза
(седации). Учитывая частоту болевых синдромов как причин проведения
анестезиологического пособия при томографии, в арсенал медикаментов
целесообразно включить анальгетики, в том числе наркотические.
Распространенность судорожных двигательных реакции конечностей как
причин анестезиологического пособия у больных в ясном сознании,
обусловливает целесообразность рассмотрения регионарной анестезии как
альтернативы внутривенному наркозу для обеспечения неподвижности
больного.
Литература
1. Харрис Д. Анестезия и наблюдение во время магнитно-резонансной
томорафии // Актуальные проблемы анестезиологии и реаниматологии.
Освежающий курс лекций. – Архангельск – Тромсё – 1997. – С. 113-116.
2. Чеченин М. Г., Воробьева Л. А., Кузина И. Р. Анестезиологическое
обеспечение при компьютерной и магнитно-резонансной томографии //
Тезисы 7-го Всероссийского Съезда анест. и реаниматол. – С-Пб. –
2000. – С. 299
3. Согомонян С. А., Кочарян А. Г., Агабекян Г. Г. Проведение анестезии
при магнитно-резонансной томографии // Анест. и реаниматол. – 2000. № 4. – С. 41- 44.
М.Г.Чеченин
СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ КАУДАЛЬНОГО ЭПИДУРАЛЬНОГО
ПРОСТРАНСТВА ПРИ КАУДАЛЬНОЙ АНЕСТЕЗИИ
Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей
Новокузнецкий родильный дом №1
Проведение каудальной анестезии в 15-35% случаев сопровождается
техническими неудачами, что связано с трудностью идентификации
расположения иглы в каудальном эпидуральном пространстве [1-6].
В связи с этим проблема поиска надежных критериев правильности
расположения иглы в каудальном пространстве представляется нам весьма
актуальной.
Цель исследования
Повышение эффективности каудальных анестезий путем улучшения
качества идентификации каудального эпидурального пространства. В ходе
достижения поставленной цели нами был разработан и апробирован новый
Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]