6.3.Метод фиксации мембранного потенциала. Ионные токи. Ионные каналы

Для доказательства решающей роли ионных токов в генерации нервного импульса были поставлены знаменитые опыты с фиксацией мембранного потенциала

(Ходжкин, Хаксли и др.)

Поддержание постоянного напряжения при исследовании ионных токов через возбужденную мембрану позволяло:

1. избавиться от емкостных токов = 0

2. исключить изменение ионных проводимостей

и при изменениии изучить их изменение во времени в различные фазы развития возбуждения:g = f(t)

Постоянная разность потенциалов между внутренней и наружной поверхностями мембраны поддерживается при помощи специальной электронной схемы (рис. 6.4), ключевой элемент которого – операционный усилитель (ОУ) (в основном, ОУ представляют собой усилители постоянного тока, охваченные глубокой отрицательной обратной связью по напряжению).

Рис. 6.4 Схема исследования токов через мембрану с фиксацией мембранного потенциала (объяснения в тексте)

Между входами ОУ – разность потенциалов микроэлектрода, помещенного внутрь аксона кальмара (I), и электрода сравнения (2), то есть мембранный потенциал

. С выхода операционного усилителя напряжение подается на серебряную проволочку (3), расположенную по оси аксона. Электронная схема удерживает на выходе (внутри аксона) тот же потенциал, что на входе ОУ, таким образом удерживается постоянный мембранный потенциал:. При помощи источника постоянного напряжения (4) можно «ступенькой» изменить входное напряжение ОУ, например, поднять его выше порогового (рис. 6.5 а). Электронная схема будет удерживать это заданное напряжение во время опыта. Амперметр (5) измеряет протекающий при этом через мембрану токI_M(между электродом сравнения (2) и выходящим электродом ОУ (3) (рис. 6.4). В опытах с фиксацией напряжения можно исследовать изменение мембранного тока во времени, при развитии возбуждения, задавая разные постоянные значения мембранного потенциала.

Если ток направлен из клетки наружу в окружающий раствор, его считают положительным, если внутрь клетки из окружающего раствора – отрицательным.

Обнаружено, что если поднять мембранный потенциал выше порогового >(рис. 6.5 а), сначала течет ток внутрь клетки (I_м < 0), а затем из клетки наружу (I_м> 0) (рис. 6.5 б).

Рис. 6.5 Результаты исследований мембранного тока методом фиксации напряжения (объяснения в тексте)

В блестящих экспериментах, проведенных Ходжкиным, Хаксли, Байкером, Шоу, было убедительно доказано, что фаза Iмембранного тока (< 0) связана с потоком ионов натрия из окружающей среды (где концентрация натрия []_нар больше) в клетку, (где концентрация натрия []_вн меньше), а фаза 2 объясняется вытеканием ионов калия из клетки наружу

([ ]_вн > []_нар).

В своих опытах исследователи изменяли ионный состав окружающего раствора. Было обнаружено, что если снаружи убирали натрий, первая фаза мембранного тока (ток внутрь клетки) пропадала. Следовательно, на самом деле, первая фаза развития потенциала действия связана с увеличением проницаемости мембраны для ионов натрия. Поток положительных частиц в клетку приводит к деполяризации мембраны – внутренняя её поверхность заряжается положительно по отношению к наружной.

Во второй фазе – когда происходит реполяризация мембраны и восстанавливается отрицательный мембранный потенциал, резко увеличивается проницаемость мембраны для калия и из клетки наружу выходят положительно заряженные ионы калия, в то время как натриевый ток уменьшается.

Такой ионный механизм развития потенциала действия был окончательно доказан в решающем эксперименте Ходжкина, Бейкера и Шоу, в котором аксоплазму препарированного аксона заменили на наружный раствор, а ионный состав наружного раствора сделали таким же, как у нормальной аксоплазмы. При такой замене ионных составов изменила знак разность потенциалов на мембране. Теперь в покое её внутренняя поверхность была заряжена положительно по отношению к наружной. А потенциал реверсии оказался отрицательным. Была выдвинута гипотеза, что селективное (избирательное) изменение ионной проницаемости возбужденной мембраны: сначала для Na⁺, а потом дляK⁺ объясняется тем, что в мембране имеются специальные ионные «каналы» ( поры, образованные белковыми молекулами). Существуют отдельно натриевые и калиевые каналы, которые открываются и закрываются во время прохождения через данный участок мембраны нервного импульса. В первой фазе открываются натриевые каналы, во второй фазе – калиевые. Соответственно, затем сначала закрываются натриевые каналы, а потом калиевые. Открывание и закрывание ионных каналов вызывается изменением мембранного потенциала.

Одно из доказательств наличия в мембране ионных каналов – существование веществ, блокирующих ионные потоки через мембрану.

Так, содержащийся в скалозубой рыбе фугу тетродотоксин блокирует поступление внутрь клетки натрия и, таким образом, нарушает передачу нервного импульса, что может привести к летальному исходу. Доказано, что тетродотоксин не влияет на проницаемость клетки для калия, значит, ионы натрия и калия, на самом деле, проходят через разные каналы.

Из-за своего специфического строения молекулы тетродотоксина застревают в натриевых каналах. Подсчитав число застрявших в мембране молекул тетродотоксина, удалось определить количество натриевых каналов. В разных нервных волокнах оно было разным – от 3 до 75 каналов на один квадратный микрометр площади мембраны (для сравнения количество молекул фосфолипидов ~2*10⁶

Был обнаружен и специфический ингибитор калиевых каналов – тетраэтиламмоний.

Если обработать мембрану тетродотоксином, блокирующим натриевые каналы, в опытах с фиксацией мембранного потенциала пропадает Iфаза (рис. 6.5), а тетраэтиламмоний, прекращающий перенос через мембрану калия, вызывает исчезновение 2 фазы.

Таким образом, было установлено, что формирование потенциала действия вызывается ионными потоками через мембрану: сначала ионов натрия внутрь клетки, а затем ионов калия из клетки в наружный раствор (рис. 6.1в, 6.6).

Рис. 6.6 Изменение проводимости мембраны для ионов калия и натрия во время развития потенциала действия

g_Na- проводимость для натрия,g_k- для калия,- мембранный потенциал ( для аксонов и для скелетных мышц).

Временные зависимости мембранных токов при формировании потенциала действия в аксонах и скелетных мышцах можно поэтому представить так: ( рис. 6.7)

Рис. 6.7. Временные зависимости мембранного потенциала - а, суммарного ионного тока через мембрану-б, натриевого тока – в и калиевого тока – г при формировании потенциала действия (в аксонах и скелетных мышцах).

6.4.Распространение нервного импульса вдоль возбудимого волокна

Рис. 6.8. Распространение нервного импульса вдоль возбудимого волокна. В – зона возбуждения, П – зона покоя, Р –зона рефрактерности, Л. Т. – локальные токи, v– скорость распространения нервного импульса.

Если в каком-нибудь участке возбудимой мембраны сформировался потенциал действия, мембрана деполяризована, возбуждение распространяется на другие участки мембраны. Рассмотрим распространение возбуждения на примере передачи нервного импульса по аксону (Рис 6.8). И в аксоплазме, и в окружающем растворе возникают локальные токи: между участками поверхности мембраны с большим потенциалом (положительно заряженными) и участками с меньшим потенциалом (отрицательно заряженными) ( рис 6.8 а).

Локальные токи образуются и внутри аксона и на наружной его поверхности. Локальные электрические токи приводят к повышению потенциала внутренней поверхности невозбужденного участка мембраны и к понижению - наружного потенциала невозбужденного участка мембраны, оказавшегося по соседству с возбужденной зоной. Таким образом, отрицательный потенциал покояуменьшается по абсолютной величине, то есть повышается. В областях, близких к возбуждённому участку,повышается выше порогового значения. Под действием изменения мембранного потенциала открываются натриевые каналы и дальнейшее повышениепроисходит уже за счет потока ионов натрия через мембрану.

Происходит деполяризация мембраны, развивается потенциал действия. Затем возбуждение передается дальше на покоящиеся участки мембраны (рис. 6.8 б).

Может возникнуть вопрос, почему возбуждение распространяется по аксону не в обе стороны от зоны, до которой дошло возбуждение, ведь локальные токи текут в обе стороны от возбужденного участка. Дело в том, что возбуждение может распространяться только в область мембраны, находящуюся в состоянии покоя, то есть в одну сторону от возбужденного участка аксона. В другую сторону нервный импульс не может распространяться, так как области, через которые прошло возбуждение, некоторое время остаются невозбудимыми – рефрактерными.

Повышение мембранного потенциала – величина деполяризующего потенциала V=, передаваемого от возбужденных участков вдоль мембраны, зависит от расстояния х (как это следует из теории, основанной на уравнениях Ходжкина-Хаксли) по формуле:

V(x) = V₀

В этой формуле: - повышение мембранного потенциала в зоне возбуждения по сравнению с потенциалом покоя, х – расстояние от возбужденного участка;- константа длины нервного волокна, равная расстоянию, на котором деполяризующий потенциал уменьшается в е раз (рис. 6.9).

На рис. 6.9 эта зависимость представлена графически:

х

Рис.6.9. Зависимость деполяризующего потенциала от расстояния

Константа длины нервного волокна равна:

( 6.4 )

где r- радиус нервного волокна; ℓ - толщина мембраны;- удельное сопротивление мембраны;- удельное сопротивление аксоплазмы.

Чем на большее расстояние передается деполяризация мембраны, чем меньше Vуменьшается с расстоянием, то есть чем больше константа длины нервного волокна, тем больше скорость распространения нервного импульса - тем больше, чем больше радиус аксонаr, толщина мембраны ℓ и удельное сопротивление мембраны ρ_ми чем меньше удельное сопротивление аксоплазмы ρ_а .

Большую скорость распространения нервного импульса по аксону кальмара обеспечивает их гигантский по сравнению с аксонами позвоночных радиус r. У позвоночных большая скорость передачи возбуждения в нервных волокнах осуществляется другими способами. Аксоны позвоночных снабжены миелиновой оболочкой, которая увеличивает удельное сопротивление мембраныи ее толщину ℓ (рис. 6.10 )

Рис. 6.10 Сальтаторное распространение потенциала действия по миелинизированному волокну от одного перехвата Ранвье к другому.

Возбуждение по миелинизированному волокну распространяется сальтаторно (скачкообразно) от одного перехвата Ранвье (участка свободного от миелиновой оболочки) до другого.

Нервные импульсы проводятся по аксонам в какой-то степени аналогично тому, как передаются электрические сигналы по кабельно-релейной линии. Электрический импульс передается без затухания за счет его усиления на промежуточных релейных станциях, роль которых в аксонах выполняют участки возбудимой мембраны, в которых генерируются потенциалы действия за счет процессов метаболизма клетки, энергии АТФ, ионных насосов, создающих градиенты концентраций ионов натрия и калия на мембране.

ВОПРОСЫ И ЗАДАЧИ К ГЛАВЕ 6

1.Что такое потенциал действия? Какую роль он выполняет в организме? Какое значение имеет его исследование для фармации и медицины?

2. Какие процессы в биологической мембране формируют потенциал действия? Какие опыты позволили выяснить механизм образования потенциала действия?

3. Представьте на одном графике временные зависимости мембранного потенциала участка аксона кальмара при его возбуждении:

1) если концентрации калия внутри и снаружи клетки 360 ммоль/л и 10 ммоль /л соответственно, а для натрия эти величины - 70 ммоль/л и 420 ммоль/л; 2) если концентрация калия внутри клетки уменьшится до 200 моль/л, а наружная концентрация натрия уменьшится до 300 ммоль/л.

( Для решения задачи вычислите, воспользовавшись формулой Нернста для мембранного потенциала, потенциалы покоя и реверсии для обоих случаев. Время потенциала действия примите 3 мс).

4.В условиях задачи 3 найдите амплитуды потенциала действия для обоих случаев.

5. В старину в Москве случались соляные бунты. Объясните причину этих печальных событий с точки зрения биофизики нервного импульса.

6. Почему нервный импульс в аксоне распространяется от возбуждённого участка только в одну сторону?

7. Какова одна из причин, обуславливающая большую скорость распространения нервного импульса по аксону: кальмара? Леопарда? Футболиста?