2.5. Физические свойства мембран и методы их исследования.

Исследования физико-химических свойств биологических мембран имеют большое значение для медико-биологической науки и для практической медицины. Режим функционирования мембраны резко зависит от микровязкости липидного бислоя, от подвижности фосфолипидных молекул в мембране, от фазового состояния мембранных липидов.

Отклонения биофизических характеристик липидного бислоя от нормы связано с разного рода патологиями. Важную роль в физиологии клетки играют фазовые переходы в биологических мембранах. Их изучение позволяет вскрыть мембранный механизм ряда жизненно важных клеточных процессов, а также первичный механизм развития ряда патологий. Применение в медицине биофизических методов изучения физико-химических свойств клеточных мембран позволяет разрабатывать новые эффективные способы диагностики и лечения.

Липидная фаза биологических мембран при физиологических условиях (температуре, давлении, химическом составе окружающей среды) находится в жидком агрегатном состоянии. Это доказано физическими методами флюоресцентного анализа ( с использованием флюоресцентных зондов и меток) и методами радиоспектроскопии : ЭПР (с использованием спиновых зондов и меток) и ЯМР.

В нормальном состоянии мембрана не флюоресцирует. Чтобы провести исследования мембраны флюоресцентным методом, надо вводить в мембрану молекулы или молекулярные группы, способные к флюоресценции.

Флюоресцентный анализ даёт возможность исследовать подвижность фосфолипидных молекул в мембране, оценить вязкость липидной фазы мембраны (так называемую микровязкость мембран). Микровязкость мембраны можно оценить по смещениям спектров флюоресценции в более коротковолновую область при увеличении вязкости, а также по степени поляризации флюоресцентного излучения при освещении мембраны поляризованным светом.

Степень поляризации излучения Р показывает, какую долю составляет интенсивность поляризованного света I _поляр в общей суммарной интенсивности флюоресценции I _сумм. (см. рис.2.16)

Возбуждающее излучение Флюоресценция

(поляризованное) (частично поляризованное излучение)

Р₀ =1 Р‹1

МЕМБРАНА

Рис. 2.16. Схема оценки микровязкости мембраны по степени поляризации флюоресценции (объяснения в тексте).

При освещении мембраны полностью поляризованным светом P₁ = 1

все векторы напряженности электрического поля колеблются в одной плоскости.

Излучаемая флюоресценция оказывается лишь частично поляризованной (P < 1) , так как после поглощения квантов возбуждающего излучения за время пребывания в возбужденном состоянии ( τ 10^-8 c ) часть флюоресцирующих молекул успевает повернуться и ориентация колебаний E изменится. Чем больше подвижность молекул, чем меньше микровязкость η, тем меньше степень поляризации Р.

Связь Р и η дается формулой Перрена и Яблонского

-= (-)(1 +τ)

,

Где P₀ - степень поляризации света возбуждения, R - универсальная газовая постоянная, Т – температура, V – молярный объем флюоресцирующих молекул, τ – время жизни возбужденного состояния.

Наиболее полные сведения об агрегатном состоянии липидных бислоев дают методы радиоспектроскопии – электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

Электронный парамагнитный резонанс дает возможность судить о подвижности молекул в липидном бислое по ширине спектров – ЭПР-графиков зависимости мощности поглощения энергии СВЧ-электромагнитного поля от значений индукции постоянного магнитного поля, в которое помещены парамагнитные молекулы.

Так как молекулы фосфолипидов диамагнитны, для ЭПР-исследований используются спин-зонды и спин-метки – молекулы или молекулярные группы с неспаренными электронами.

Парамагнитные спин-зонды вводятся в липидную мембрану. Спектры поглощения спин-зондами СВЧ-электромагнитного поля дают информацию о свойствах липидного окружения, в частности, дают информацию о подвижности липидных молекул в мембране. Чем больше подвижность молекул, чем меньше микровязкость, тем слабее влияние локальных магнитных полей, созданных соседними молекулами, тем меньше размыты спектры ЭПР (рис. 2.17).

Рис. 2.17 Изменение спектров ЭПР при увеличении подвижности,уменьшении микровязкости ή.

Несмотря на ценную информацию, которую удалось получить при исследовании биологических объектов методом ЭПР с использованием спиновых зондов, этот метод обладает тем существенным недостатком, что внесение в биологический объект чужеродных молекул-зондов меняет структуру объекта.

От этого недостатка свободен метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР). ЯМР аналогичен ЭПР. В биологическом объекте содержится много парамагнитных ядер - протонов, что дает возможность применять для их исследования ЯМР.

По той же причине, что и в случае ЭПР – вследствие разных локальных магнитных полей, создаваемых в разных точках ядерным и электронным окружением резонирующего ядра, спектры ЯМР размыты тем меньше, чем больше молекулярная подвижность

Флюоресцентные, ЭПР и ЯМР исследования показали, что подвижность фосфолипидных молекул в мембране сравнительно велика, а вязкость мала. В нормальных физиологических условиях липидная часть мембраны находится в жидком агрегатном состоянии. Вязкость липидной мембраны сравнима с вязкостью подсолнечного масла: (30 – 100) мПа с.

(для сравнения, вязкость воды при 20°С 1 мПа·с).

Изменение микровязкости липидного окружения мембранных белков – ферментов резко сказывается на их функционировании. Многие болезни связаны с отклонением микровязкости липидной фазы от нормы. Некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что канцерогенез связан со снижением вязкости липидной фазы мембраны, а при старении вязкость, напротив, увеличивается. Разрабатываются диагностические методы, основанные на измерении микровязкости мембран с помощью спин-зондов.

Любопытно, что микровязкость мембраны у концов липидных хвостов меньше, а молекулярная подвижность соответственно больше, чем около полярных голов. Это доказано методом ЭПР с использованием спин-меток, молекулярных групп, обладающих неспаренным электроном. Спиновые метки присоединялись к разным местам фосфолипидной молекулы.

Рис. 2.8 Два способа прикрепления спиновой метки к фосфолипидной молекуле и различие спектров ЭПР для этих двух случаев.

Как видно из рисунка 2.8, второму положению спиновой метки соответствует более узкий спектр ЭПР, а следовательно, подвижность участка 2 фосфолипидной молекулы больше, чем участка 1. Поэтому в середине мембраны упорядоченность во взаимном расположении хвостов фосфолипидных молекул меньше (см. следующий параграф).

Высокая подвижность липидных молекул обусловливает латеральную (боковую) диффузию.

Латеральная диффузия – это хаотическое тепловое перемещение молекул липидов и белков в плоскости мембраны.

При латеральной диффузии рядом расположенные молекулы липидов скачком меняются местами и вследствие таких последовательных перескоков из одного места в другое молекула перемещается вдоль поверхности мембраны.

Перемещение молекул по поверхности мембраны клетки sза времяtопределено экспериментально методом флюоресцентных меток – флюоресцирующих молекулярных групп, присоединенных к исследуемым молекулам. Флюоресцентные метки делают флюоресцирующими молекулы, движение которых по поверхности клетки можно изучать, например, исследуя под микроскопом скорость расплывания по поверхности клетки флюоресцирующего пятна, созданного такими молекулами. Остроумный прием, используемый с целью определения скорости перемещения флюоресцирующих молекул – «фотовысвечивание». В клетку вводят молекулы, меченные флюоресцентными метками, а затем небольшой участок клеточной поверхности (несколько квадратных микрометров) высвечивают лазерным лучом. Под действием лазерного луча молекулы теряют способность флюоресцировать. Измеряя скорость восстановления флюоресценции в высвеченной области, скорость уменьшения радиуса высвеченного пятна, излучают скорость латеральной диффузии.

Оказалось, что среднее квадратичное перемещение за секунду фосфолипидной молекулы по поверхности мембраны составило около 5 мкм, что сравнимо с размерами клеток. Таким образом, за секунду молекула может обежать всю поверхность небольшой клетки. Обнаруженное среднее квадратичное перемещение белковых молекул составило ≈ 0.2 мкм за 1 секунду.

Частота перескоков (число перескоков за секунду) молекулы с одного места на другое вследствие латеральной диффузии ≈ 10⁷ – 10⁸ 1/с

Каждая молекула фосфолипида, таким образом, в среднем претерпевает десятки миллионов перестановок в плоскости мембраны за секунду, по одному перескоку через время . τ ≈ - 10^-8 с.

Флип-флоп – это диффузия молекул мембранных фосфолипидов поперек мембраны, когда меняются местами две противостоящие молекулы (рис. 2.19).

Рис. 2.19 Латеральная диффузия (1), флип-флоп (2).

Скорость перескоков молекул с одной поверхности мембраны на другую (флип-флоп) определена методом спиновых меток в опытах на модельных липидных мембранах – липосомах. Часть фосфолипидных молекул, из которых формировались липосомы, метились присоединенными к ним спиновыми метками – молекулярными группами с неспаренными электронами. Липосомы подвергались воздействию аскорбиновой кислоты, вследствие чего неспаренные электроны на молекулах пропадали: парамагнитные молекулы становились диамагнитными, что можно было обнаружить по уменьшению площади под кривой спектра ЭПР. Сначала нейтрализовались неспаренные электроны молекул, расположенных на внешних поверхностях липосом, что приводило к уменьшению числа неспаренных электронов в 2 раза. Электронный парамагнитный резонанс затем определялся спин-метками на внутренних, недоступных действию аскорбиновой кислоты поверхностях фосфолипидных пузырьков – липосом. Однако площадь под спектрами ЭПР продолжала понижаться, следовательно, число неспаренных электронов уменьшалось. Это объяснялось перескоками меченых спин-метками молекул с внутренней поверхности бислойной мембраны липосомы на внешнюю – флип-флопом. По скорости уменьшения интенсивности сигнала ЭПР было установлено, что половина меченых молекул претерпевает флип-флоп примерно за 6.5 часов (рис. 2.20), поскольку примерно через 6.5 часов площадь под кривой спектра ЭПР (число неспаренных электронов) уменьшалась в два раза.

Рис. 2.20 Уменьшение со временем площади под кривой спектра ЭПР_S(числа неспаренных электроновn) при исследовании липосом, содержащих меченые спиновыми метками молекулы (объяснение в тексте).

Таким образом, перескоки молекул с одной поверхности бислоя на другую (флип-флоп) совершаются значительно медленнее, чем перескоки при латеральной диффузии. Среднее время, через которое фосфолипидная молекула совершает флип-флоп (τ ≈ 1 часа) в десятки миллиардов раз больше среднего времени, характеризующего перескоки молекулы из одного места в другое в плоскости мембраны

Сочетание быстрой диффузии молекул вдоль мембраны и очень медленной диффузии поперек мембраны имеет большое значение для функционирования мембран, а именно, для матричной функции мембраны (см. 2.1). Благодаря затруднённому переходу поперек мембраны поддерживается упорядоченность в молекулярной структуре мембраны, ее анизотропия, асимметрия (относительно плоскости мембраны) расположения липидных и белковых молекул, определенная ориентация белков – ферментов поперек мембраны. Это имеет большое значение, например, для направленного переноса веществ через мембрану .