Глава 2. Биологические мембраны

Биофизика биологических мембран – важнейший раздел биофизики клетки, имеющий большое значение для медицины и фармации. На биомембранах протекают важнейшие жизненные процессы. Многие патологии связаны с нарушениями в биологических мембранах. Лечебные воздействия во многих случаях связаны с воздействиями на биомембраны.

2.1. ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ БИОМЕМБРАН

Живая клетка – элементарная живая система, способная к самостоятельному существованию, развитию, воспроизведению – «квант жизни» – основа строения всех животных и растений.

Важнейшее условие существования клетки ( и клеточных органелл), да и вообще всех живых систем на всех уровнях их организации является сочетание:

1)автономности, отделения от окружающей среды

и

2)связи с окружающей средой, обеспечивающей обмен веществом, энергией, информацией между живой системой и окружающей средой.

Поэтому ни клетка, ни клеточные органеллы не могли бы существовать без биологических мембран.

Важнейшие функции биомембран:

1. барьерная,

2. матричная,

3. механическая.

1.Барьерная функция биологических мембран обеспечивает транспорт веществ из клетки и в клетку:

а) селективный-избирательный,

б) регулируемый,

а также

в) активный

и

г) пассивный.

а) Избирательный транспорт, например, хорошая проницаемость биомембран для воды и плохая для ионов даёт возможность создать во внутриклеточной среде повышенную по отношению к внеклеточной жидкости концентрацию ионов калия и пониженную концентрацию натрия, что играет огромную роль в жизненных процессах. Кстати, это является подтверждением того, что жизнь, возникла на нашей планете, когда вся её поверхность была покрыта морской водой ( около четырёх с половиной миллиардов лет тому назад). Первые возникшие тогда клетки, чтобы отличаться по химическому составу от окружающей среды, создали в своей цитоплазме пониженное по сравнению с морской водой содержание натрия и повышенное калия. А вот межклеточная жидкость в живых организмах осталась близка по своему химическому составу к морской воде. Как говорят:

• Море внутри нас!

б) Регулируемый транспорт обеспечивает изменение проницаемости биологической мембраны для тех или иных веществ в зависимости от физиологического состояния клетки. Например, при возбуждении клетки возбудимой ткани на короткое время резко увеличивается проницаемость мембраны для ионов натрия, а для возвращения клетки в невозбуждённое состояние возрастает проницаемость для ионов калия.

в) Пассивный транспорт – перенос вещества из мест с большей в места с меньшей его концентрацией. Например, пассивный транспорт натрия в клетку из межклеточной среды обеспечивает возбуждение клетки, а затем пассивный транспорт калия из клетки возвращает её в невозбуждённое состояние.

б) Активный транспорт – транспорт вещества из мест с его меньшей в места с большей концентрацией. Например, в процессах активного транспорта клетка закачивает в себя калий из внеклеточной жидкости и выкачивает наружу натрий.

2 .Матричная функция биологических мембран обеспечивает определённое расположение и ориентацию мембранных белков ( в том числе, мембранных белков –ферментов).

3. Механическая функция биологических мембран обеспечивает механическую прочность , автономность по отношению к окружающей среде клеток и внутриклеточных структур.

Кроме этих основных функций биологические мембраны выполняют множество других важных функций в живом организме. К ним относится рецепторная функция, энергетическая ( синтез и гидролиз аденозинтрифосфорной кислоты - АТФ на внутренней мембране митохондрий), генерация и проведение нервного импульса и многие другие.

Огромная роль мембран в жизненных процессах связана с их относительно большой совокупной площадью. Так, общая площадь всех биологических мембран в организме человека достигает десятков тысяч квадратных метров.

Многие болезни связаны с нарушением нормального функционирования мембран: канцерогенез, атеросклероз, нарушение диеты, вирусные и инфекционные заболевания, отравления, поражения организма ультрафиолетовым и ионизирующим облучением и многие другие. Лечение часто связано с воздействием на мембраны с целью нормализовать их функции.

2. . ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН С ПОМОЩЬЮ ФИЗИЧЕСКИХ МЕТОДОВ.

Первая модель строения биологических мембран была предложена в 1902 г. Овертон заметил, что через мембраны лучше всего проникают вещества, хорошо растворимые в липидах и на основании этого предположил, что биологические мембраны состоят из тонкого слоя фосфолипидов. На самом деле, на поверхности раздела полярной и неполярной среды (например, воды и воздуха) молекулы фосфолипидов образуют мономолекулярный (одномолекулярный) слой (см. рис. 1.1). Их полярные «головы» погружены в полярную среду, а неполярные «хвосты» ориентированы в сторону неполярной среды. Поэтому можно было предположить, что биологические мембраны построены из монослоя липидов.

Рис. 2.1 Мономолекулярный слой липидов на поверхности раздела полярной и неполярной среды.

В 1925 году Гортер и Грендел установили, что площадь монослоя липидов, экстрагированных из мембран эритроцитов, в два раза больше суммарной площади эритроцитов. Гортер и Грендел экстрагировал липиды из гемолизированных эритроцитов ацетоном, затем выпаривали раствор на поверхности воды и измеряли площадь образовавшейся мономолекулярной плёнки липидов. На основе результатов этих исследований было сделано предположение, что липиды в мембране располагаются в виде бимолекулярного слоя (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Бимолекулярный слой липидов.

Это предположение подтвердили исследования электрических параметров мембран (Коул и Кертис, 1935г.): высокое электрическое сопротивление и большая электроемкость на единицу площади мембраны ( 10⁷ Ом м²и О,5 10^-2 Ом/м² соответственно).

Биологическую мембрану можно рассматривать как электрический конденсатор (рис. 2.3).

Рис. 2.3. Мембрана, как конденсатор (объяснения в тексте).

Проводниковые пластины конденсатора образуют электролиты наружного и внутреннего растворов (внеклеточного и цитоплазмы).

Проводники разделены липидным бислоем. Липиды – диэлектрики с диэлектрической проницаемостью ε = 2

Емкость плоского конденсатора ,

C=(2.1)

где электрическая постоянная ε₀ = 8,85 10^-12 Ф/м - электрическая постоянная,

ℓ - расстояние между пластинами конденсатора.

Удельная ёмкость на единицу площади поверхности мембраны:

C_уд= (2.2)

Отсюда можно найти расстояние между пластинами конденсатора, примерно соответствующее в нашем случае толщине липидной части мембраны:

ℓ = м≈ 3 -4 нм (2.3)

Это как раз соответствует по порядку величины толщине неполярной части двухмолекулярного слоя липидов, сложенного определенным образом.

Вместе с тем, имелись экспериментальные данные, которые свидетельствовали о том, что биологическая мембрана состоит и из белковых молекул. Например, при измерении поверхностного натяжения клеточных мембран было обнаружено, что измеренные значения коэффициента поверхностного натяжения значительно ближе к коэффициенту поверхностного натяжения на границе раздела белок-вода (около 0.1 дин/см), нежели на границе раздела липид-вода (около 10 дин/см). Эти противоречия экспериментальным результатам были устранены Даниэлли и Девсоном, предложившими в 1935 году так называемую «бутербродную» модель строения биологических мембран, которая с некоторыми несущественными изменениями продержалась в мембранологии в течение почти 40 лет. Согласно этой модели, мембрана – трехслойная: она образована двумя расположенными по краям слоями белковых молекул, с липидным бислоем посредине (рис. 2.4); образуется нечто вроде бутерброда: липиды, наподобие масла, между двумя «ломтями» белка.

Рис.2.4 Трёхслойная «бутербродная» модель строения биологической мембраны.

Однако по мере накопления экспериментальных данных пришлось в конце концов отказаться и от «бутербродной» модели строения биологических мембран.

Огромную роль в развитии представлений о строении биологических мембран сыграло всё большее проникновение в биологию физических методов исследования.

Большую информацию о структуре мембран, о взаимном расположении атомов мембранных молекул дает рентгеноструктурный анализ (см. раздел III. 2.7), основанный на изучении дифракции коротковолновых рентгеновских лучей на атомах. Рентгеноструктурный анализ позволяет обнаруживать упорядоченность в расположении атомов и определять параметры упорядоченных структур (например, расстояния между кристаллографическими плоскостями).

Согласно формуле Вульфа-Бреггов расстояние между кристаллографическими плоскостями d, длина волны рентгеновского излучения λ и угол скольжения, соответствующий дифракционному максимуму k-го порядка связаны между собой соотношением

2 d sin θ = 𝑘 λ , 𝑘=0,1,2… (2.4)

.

Зная длину рентгеновской волны λ, можно по углу скольжения θ, соответствующему дифракционному максимуму k- го порядка, определять параметр кристаллической решетки d:

d=(2.5)

Исследования дифракции рентгеновских лучей подтвердили относительно упорядоченное расположение липидных молекул в мембране – двойной слой с более или менее параллельно расположенными жирнокислотными хвостами; дали возможность точно определить расстояние между полярной головой липидной молекулы и метильной группой в конце углеводородной цепи.

Наибольшие успехи в раскрытии особенностей строения биологических мембран были достигнуты в электронно-микроскопических исследованиях (см. раздел III, 5.2). Как известно, световой микроскоп не позволяет рассмотреть детали объекта меньше примерно половины длины волны света (около 200 нм). В световом микроскопе можно разглядеть отдельные клетки, однако он совершенно непригоден для изучения биологических мембран, толщина которых в 20 раз меньше предела разрешения светового микроскопа.

Разрешающая способность микроскопа ограничена явлением дифракции. Поэтому, чем меньше длина волны по сравнению с деталями исследуемого объекта, тем меньше искажения. Предел разрешения z пропорционален длине волны λ:

z~λ

Согласно формуле де Бройля длина волны движущегося электрона:

,

m- масса электрона,ѵ- его скорость, р – импульс электрона.

Электронам, разогнанным до больших скоростей, тоже присущи волновые свойства, в том числе явление дифракции, однако при достаточно больших скоростях длина волны де Бройля достаточно мала и соответственно мал предел разрешения электронного микроскопа. У электронов, ускоренных в электрическом поле с напряжением U= 10⁵ В, скорость

ѵ=≈10⁸

а длина волны де Бройля:

λ≈0,005 нм

Однако в силу некоторых конструктивных особенностей электронного микроскопа его предел разрешения zсоставляет не тысячные доли нанометров, а порядкаz≈0,5 нм, что, однако, уже позволяет рассмотреть отдельные детали строения биологических мембран.

В электронном микроскопе достигается увеличение в сотни тысяч раз, что позволило исследовать строение клетки, клеточных органелл и биологических мембран.

Недостатком электронной микроскопии является деформация живого объекта в процессе исследования. В электронном микроскопе нельзя рассматривать живую клетку. Перед началом электронно- микроскопических исследований клетка проходит через многие стадии предварительной обработки: обезвоживание, закрепление, ультратонкий срез, обработка препаратов соединениями тяжелых металлов, плохо пропускающих электроны (например, осмия или марганца) с целью повышения контрастности изображения. При этом изучаемый объект значительно изменяется. Несмотря на это, успехи в изучении клетки при помощи электронного микроскопа несомненны.

При помощи электронной микроскопии удалось получить изображение биологических мембран, на снимках видно трехслойное строение мембраны. Новая информация о строении мембраны была получена с помощью метода «замораживание-скол-травление». По этому методу клетку охлаждают до очень низкой температуры в жидком азоте. Охлаждение проводится с очень большой скоростью (около 1000 градусов в секунду). Затем клетки раскалываются специальным ножом и помещаются в вакуум. Твёрдая стеклообразная вода быстро возгоняется, освобождая поверхность скола (этот процесс и называют травлением). После травления получают реплику (отпечаток со сколотой поверхности), наносят на нее смесь углерода и платины и фотографируют в электронном микроскопе. Мембраны при скалывании расщепляются и вдоль границы двух липидных монослоев и поэтому можно видеть их внутреннее строение. (рис. 2.5).

Рис. 2.5. Интегральные белки, обнаруженные методом «замораживание-скол-травление» (объяснение в тексте).

Было обнаружено, что имеются белковые молекулы, погруженные в липидный биослой и даже прошивающие его насквозь, что привело к существенному изменению представлений о строении мембран.

К методам изучения динамики мембран, позволяющим исследовать их, не разрушая, относятся флюоресцентный метод и методы радиоспектроскопии – ЭПР и ЯМР (см. разделIII, 8.5). Эти методы дают сведения о движении и взаимодействии мембранных молекул и отдельных частей молекулы. Было выяснено, что при физиологических условиях липидные молекулы находятся в жидком агрегатном состоянии. Метод ЭПР показал, что не вся поверхность биологической мембраны покрыта белками. Так, например, больше половины поверхности мембраны кишечной палочки образована полярными головами липидов.