Глава 6. Люминесценция

Люминесценция широко применяется в фармации, как исключительно чувствительный метод качественного и количественного анализа, а также для контроля свойств фармацевтических препаратов. Люминесцентные методы используются в медицинской диагностике и в биофизических научных исследованиях.

6.1. ВИДЫ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

Согласно определению С.И.Вавилова, люминесценция - это

«избыточное над тепловым излучение тела при данной температуре, имеющее длительность значительно превышающую период световых волн ( 10^-15 с)».

Тепловое электромагнитное излучение тел происходит вследствие возбуждения молекул при их столкновениях в процессе теплового движения. Тепловое движение молекул есть всегда, поэтому всегда у любого тела есть тепловое излучение. При повышении температуры тепловое движение становится более интенсивным и поэтому усиливается тепловое излучение.

Люминесценция – это излучение вследствие возбуждения молекул за счёт всех остальных причин кроме теплового движения молекул. Поэтому люминесценцию называют иногда холодным свечением.

Особенность люминесценции – время послесвечения, определённая длительность свечения после прекращения действия возбуждающего фактора.

Вплоть до ХХ века человек, в основном, имел дело с тепловым излучением: солнца, костра, факела, лучины, свечи, керосиновой лампы, газового светильника, дуговой электрической лампы, электрической лампы накаливания. Люминесцентное свечение человек видел редко: свечение гнилушек, светлячков, морских организмов, полярное сияние. В ХХ веке человек всё чаще стал применять люминесцентные источники излучения: лампы дневного света, экраны телевизоров, рентгеновских аппаратов, дисплеи компьютеров, люминесцентные источники ультрафиолетового излучения и т. д. Способов возбуждения люминесценции много. В таблице 6.1 приведены некоторые виды люминесценции.

ТАБЛИЦА 6.1 НЕКОТОРЫЕ ВИДЫ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

Виды люминесценции	Способы возбуждения	Применение
Фотолюминесценция.	Поглощение фотонов света и ультрафиолетового излучения.	Методы качественного и количественного анализа, контроль качества фармацевтических материалов, медицинская диагностика, люминесцентные светильники, дорожные знаки.
Электролюминесценция.	Электрический разряд.	Люминесцентные светильники. экраны осциллографов, телевизоров, дисплеев
Катодолюминесценция.	Удары быстрых электронов.	Экраны осциллографов, телевизоров, дисплеев
Рентгенолюминесценция	Рентгеновские лучи.	Рентгеноскопия, флюорография.
Радиолюминесценция.	Радиоактивное излучение.	Индикаторы радиоактивности.
Хемилюминесценция.	Химические реакции.	Биологические и биофизические исследования. Медицинская диагностика.

6.2. ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ. ФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ. ФОСФОРЕСЦЕНЦИЯ

Фотолюминесценция возникает под действием облучения вещества видимым светом или невидимым ультрафиолетовым излучением. По длительности послесвечения фотолюминесценция разделяется на флюоресценцию (длительность послесвечения 10^-7 с.) и фосфоресценцию (длительность послесвечения 10^-3 с, иногда до нескольких часов и даже суток).

На рисунке 6.1 показаны: возбуждение (1), флюоресценция (2), фосфоресценция (3) и безызлучательный переход (4).

Рис. 6.1. Квантовые переходы при возбуждении (1), флюоресценции (2), фосфоресценции (3) и безызлучательно переходе (4).

Возбуждение (1) происходит при поглощении и фотона h_в . Если при этом электрон переходит с основного синглетного энергетического уровня s₀ , на котором два электрона с противоположно направленными спинами, на возбуждённые синглетные энергетические уровни s*₁ , s*₂ и т. д. , направление спина возбуждаемого электрона не меняется. Возвращение на основной уровень может происходить разными способами. Либо излучательно (2) – это флюоресценция, потому что на синглетном уровне электрон долго не задерживается. Либо безызлучательно (4), тогда энергия возбуждённого электрона превращается в энергию теплового движения молекул. Чаще всего электрон сначала безызлучательно переходит на первый возбуждённый уровень, а потом с излучением на основной. Но иногда электрон оказывается на триплетном уровне, когда его спин оказывается направленным в ту же сторону, что и у электрона, оставшегося на основном уровне. Теперь возвращение электрона на основной уровень без оборота спина запрещено принципом Паули. А на оборот спина требуется время. Поэтому электрон задерживается на триплетном уровне значительно дольше, чем на основном и переход с него сопровождается фосфоресценцией (3).

6.3. СПЕКТР ФОТОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ. ПРАВИЛО СТОКСА

Спектры фотолюминесценции – зависимости спектральной плотности интенсивности люминесценции от длины волны I_λ () показаны на рис.6.2 (а, б. ). Спектральная плотность интенсивности – интенсивность в узком интервале длин волн, делённая на ширину этого интервала.

На этих же рисунках показаны спектры поглощения – зависимости оптической плотности от длины волны D ().

а) б)

Рис.6. 2. Спектр фотолюминесценции и спектр поглощения. (Обьяснение в тексте).

Согласно правилу Стокса максимум спектра люминесценции обычно сдвинут в сторону более длинных волн по сравнению с максимумом спектра поглощения (рс.6 2 а). Это объясняется тем, что чаще всего не вся энергия поглощённого фотона возбуждающего излучения h_в идёт на создание фотона люминесценции h_л. Часть энергии превращается в энергию теплового движения молекул при безызлучательных переходах.

h_л < h_в , поэтому _л < _в и _л > _в .

Наблюдается и обратное явление (рис.6.1 б), так называемое антистоксовское излучение (АС). Его особенно хорошо можно зафиксировать, если возбуждающее излучение – монохроматическое – в узком интервале длин волн. Фотоны возбуждающего излучения, попадая на молекулу, которая уже находилась в возбуждённом состоянии, вызывают излучение фотонов, энергия которых складывается из энергии возбуждающего фотона и энергии возбуждённой молекулы. Поэтому у люминесцентных фотонов энергия больше, чем у возбуждающих, а длина волны меньше.

6.4. ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. ПРИМЕНЕНИЕ В ФАРМАЦИИ И МЕДИЦИНЕ

Спектры люминесценции индивидуальны для каждого вещества – поэтому можно проводить качественный химический анализ. По интенсивности люминесценции можно определять очень малые концентрации исследуемого вещества – 10^-8 моль /л – можно проводить количественный анализ. Исключительная чувствительность люминесцентного анализа позволила использовать его в различных научных и практических исследованиях в химии, фармации, биологии, биофизике. Некоторое ограничение применения люминесцентного анализа связано с тем, что не все вещества обладают способностью к фотолюминесценции. Поэтому широкое применение нашёл метод флюоресцентных зондов и меток. Флюоресцентные зонды – это молекулы веществ, способных к флюоресценции, которые вводятся в исследуемый объект и связаны с молекулами объекта исследования межмолекулярными связями. Флюоресцентные метки – флюоресцентные молекулы, присоединяемые к молекулам объекта химическими связями. В люминесцентном анализе в качестве возбуждающего излучения обычно применяется невидимое ультрафиолетовое излучение. Согласно правилу Стокса, флюоресценция происходит на более длинных волнах видимого света, который и наблюдается и исследуется.

Люминесцентный анализ широко применяется в фармации для сортировки фармацевтического сырья, в частности, растительного происхождения, определения начальной стадии его порчи и для научных исследований лекарственных веществ, пищевых добавок, витаминов, ядов.

В медицинской диагностике свечение характерным цветом некоторых поверхностных участков тела под действием ультрафиолетового излучения даёт возможность диагностировать ряд кожных заболеваний.

В биофизике флюоресцентные зонды и метки дают возможность исследовать подвижность мембранных фосфолипидных молекул и проницаемость мембран для некоторых веществ. По изменению спектра люминесценции ряда биомакромолекул, например, некоторых белков можно судить о структурных изменениях в них, а также изучать химические превращения и межмолекулярные взаимодействия.

Активно используется люминесцентный анализ в судебной медицине и вообще в криминалистике, например, для выявления пятен крови, прочтения невидимых записей и т.д.

6.5. ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ

Хемилюминесценцию биологических объектов принято разделять (может быть, терминологически и не очень удачно) на биолюминесценцию и биохемилюминесценцию.

Биолюминесценция наблюдается у незначительного числа биологических объектов: у светлячков, у некоторых морских организмов, бактерий и грибов. Она сопровождает окисление особых веществ люциферинов в присутствии катализатора люциферазы. Свечение зелёным цветом в интервале длин волн 420 - 470 нм.

Биохемилюминесценция (или сверхслабое свечение) происходит в диапазоне длин волн 300 – 800 нм. Это излучение в 100 раз слабее биолюминесценции и не воспринимается человеческим глазом. Для его исследования применяются специальные чувствительные приборы – фотоумножители. Сверхслабое свечение ( этот термин представляется более удачным) присуще всем биологическим объектам. Оно возникает при рекомбинации свободных радикалов (с.р.). Изучение с. р. исключительно важно для фармации и медицины. Большинство химических реакций в организме происходит при участии с. р. В том числе, и особенно, при различного рода патологиях: при лучевых поражениях, при ишемической болезни сердца, при канцерогенезе и т.д. Особенно опасны перекисные с.р. жирных кислот. Важнейшая задача фармации - разработка антиоксидантов, их нейтрализующих. Для выяснения действенности этих препаратов нужен точный метод определения концентрации с.р. Один из таких методов основан на измерении интенсивности хемилюминесценции I_х.л., сопровождающей рекомбинацию перекисных с. р. жирных кислот R₂ .

I_х.л = k _х.л. [R₂]², k – константа скорости химической реакции рекомбинации с. р. жирных кислот, R₂ – их концентрация, а _х.л – квантовый выход хемилюминесценции – отношение числа квантов хемилюминесценции к числу возбуждённых продуктов реакции рекомбинации с. р.

Изучение сверхслабого свечения используется для дифференциальной диагностики, например, чтобы отличить рак лёгких от тяжёлого воспаления лёгких и т.д.

ВОПРОСЫ И ЗАДАЧИ К ГЛАВЕ 6

1. В чём отличие люминесценции от теплового излучения?

2. Какой физический закон в основе правила Стокса?

3. Ультрафиолетовое излучение с длиной волны 300 нм возбуждает фотолюминесценцию исследуемого образца на длине волны 600нм. Какая часть энергии возбуждающего излучения расходуется на безизлучательные переходы? В какой вид энергии превращается при этом энергия электромагнитной волны?

4. Какую информацию об исследуемом объекте даёт люминесцентный анализ? В чём его преимущества? Какие у него недостатки и как они преодолеваются?

5. Для чего в фармации и медицине применяется хемилюминесцентный анализ?

6. Интенсивность хемилюминесценции жирной кислоты в атмосфере кислорода равна I_х.л. = 2×10⁴ с^-1. Определить концентрацию перекисных радикалов липидов [R₂], если квантовый выход j = 10^-6, константа скорости рекомбинации радикалов К = 2×10¹⁴ моль^-2×с^-1×л².