17.Рост и размножение микроорганизмов. Механизмы размножения бактерий. Скорость и фазы размножения.

Для большинства бактерий характерно поперечное бинарное деление, приводящее к образованию двух дочерних клеток. У грамположительных бактерий при этом происходит синтез перегородки между делящимися клетками. Перегородка начинает формироваться на периферии и «движется» к центру клетки. Для грамотрицательных бактерий характерно первоначальное формирование перетяжки, отделяющей клетки.

Деление бактериальной клетки начинается спустя некоторое время после завершения цикла репликации хромосомы. Это означает, что каждая из двух нитей ДНК хромосомы служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи ДНК.

Процесс репликации ДНК бактерии продолжается до тех пор, пока не удвоится вся ДНК.

При внесении бактерий в питательную среду они растут и размножаются до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых компонентов среды не достигает минимума, после чего рост и размножение прекращаются.

Фазы роста:

•Начальная —охватывает промежуток времени между посевом и началом размножения. Ее продолжительность в среднем 2—5 ч и зависит от состава питательной среды и возраста засеваемой культуры.

• Экспоненциальная фаза характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость зависит от вида бактерий и питательной среды.

•Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться.

• Фаза отмирания наступает вследствие накопления кислых продуктов обмена или в результате аутолиза под влиянием собственных ферментов.

На жидких питательных средах рост и размножение бактерий проявляются в виде диффузного помутнения, образования осадка или пленки.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопление клеток — колонии, которые принято считать потомком одной клетки.

18.Ферменты бактерий, их биологическая роль. Методы изучения ферментативной активности бактерий и ее использование для идентификации бактерий.

В основе всех метаболических реакций в бактериальной клетке лежит деятельность ферментов, которые принадлежат к 6 классам: оксиредуктазы, трансферазы, гидролазы, лигазы, лиазы, изомеразы. Ферменты, образуемые бактериальной клеткой, могут как локализоваться внутри клетки — эндоферменты, так и выделяться в окружающую среду — экзоферменты.

Экзоферменты играют большую роль в обеспечении бактериальной клетки доступными для проникновения внутрь источниками углерода и энергии.

К ферментам агрессии относятся: гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, протеазы, фибринолизин, гемолизин, лейкоцидин.

Конститутивные ферменты – это ферменты, которые синтезируются клеткой с постоянной скоростью, независимо от наличия субстрата в среде.

Индуцибельные ферменты образуются только в присутствии соответствующего субстрата в среде.

Некоторые ферменты локализованы в периплазматическом пространстве бактериальной клетки. Они участвуют в процессах переноса веществ в бактериальную клетку.

Дифференциально-диагностические среды служат для изучения ферментативной активности бактерий. Они состоят из простой питательной среды с добавлением субстрата, на который должен подействовать фермент, и индикатора, меняющего свой цвет в результате ферментативного превращения субстрата.

Ферменты, разлагающие углеводы определяют на дифференциально-диагностических средах Гисса. В состав сред Гисса входит 1% пептонная вода, индикатор, поплавок для улавливания газа и 0,5% одного из углеводов (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза, крахмал и т.д.). При ферментации углевода до кислоты меняется только цвет среды. При ферментации углевода до кислоты и газа меняется цвет среды и в поплавке накапливаются пузырьки газа.

Протеолитическая активность бактерий оценивается по расщеплению белка с образованием индола (расщепление триптофана), аммиака (разложение фенилаланина), сероводорода (разложение серосодержащих аминокислот – цистина, цистеина, метионина).

Индол: индикатор - щавелевая кислота; первоначально белая бумага окрашивается в розовый цвет.

Аммиак: индикатор – лакмус; первоначально розовая бумага окрашивается в синий цвет.

Сероводород; индикатор – ацетат свинца; первоначально белая бумага окрашивается в черный цвет (образование сульфата свинца).

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры уколом в столбик 10-20% желатина по наличию и характеру разжижения среды (в виде перевернутой елочки, гвоздя, воронки, наполненной разжиженным желатином).

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры в столбик свернутой сыворотки по ее разжижению.

Протеолитическую активность бактерий можно определить путем посева чистой культуры на молочный агар Эйкмана по образованию зон просветления (протеолиза) вокруг колоний.

Определение каталазы проводят следующим образом: на предметное стекло наносят исследуемую культуру и добавляют каплю 3% раствора перекиси водорода. Выделение пузырьков кислорода указывает на наличие у микроба каталазы.

Определение ДНКазы проводят на агаре, содержащем ДНК в конечной концентрации и хлорид кальция. После выращивания наносят раствор соляной кислоты. При положительной реакции вокруг колоний на мутном фоне образуется прозрачная зона деполимеризованной ДНК.

Определение гемолизина проводят на кровяном агаре:

- альфа-гемолиз – зеленовато-коричневый ореол вокруг колоний (гемоглобин разрушен до метгемоглобина);

- бета-гемолиз – прозрачная зона гемолиза вокруг колоний (гемоглобин разрушен полностью);

- гамма-гемолиз – видимая зона гемолиза отсутствует.

На разной ферментативной активности бактерий основаны многие дифференциально-диагностические среды, например, среды Эндо, Левина и Плоскирева, используемые при диагностике кишечных инфекций.

Среда Эндо состоит из МПА, лактозы и индикатора (фуксин с сульфитом натрия - фуксин-сернистая кислота). Среда бледно-розового цвета. Микробы, имеющие фермент лактазу, ферментируют лактозу с образованием альдегидов, и фуксин-сернистая кислота переходит в альдегид-сернистое соединение. Фуксин восстанавливается, окрашивая колонии в красный цвет с металлическим блеском. Лактозоотрицательные бактерии образуют бесцветные (серовато-белые) колонии.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы и индикатора (метиленовый синий, эозин, и калия гидроортофосфат). Эта среда красно-фиолетового цвета. Лактозоположительные бактерии образуют колонии темно-синего цвета с зеленым блеском, лактозоотрицательные - бесцветные (серовато-белые) колонии.

Агар Плоскирева состоит из МПА, лактозы и индикатора (бриллиантовый зеленый, соли желчных кислот, йод, нейтральный красный). Среда коричневато- красного цвета. Эта среда является не только дифференциально-диагностической, но и элективной, так как она подавляет рост многих микроорганизмов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов и дизентерии.