Методы исследования в медицинской бактериологии

5

Введение

Потребность в обнаружении бактерий в клиническом материале, в пробах с объектов окружающей среды и их идентификация возникает перед исследователями

вследующих ситуациях:

-микробиологическая диагностика инфекционных болезней;

-установление этиологии и причин вспышек инфекционных заболеваний;

-выявление контаминации объектов окружающей среды микроорганизмами,

втом числе патогенными;

-анализ микробиологического загрязнения продуктов питания, косметических и лекарственных препаратов и другой продукции;

-производство вакцин, антибиотиков и других биологически активных продуктов;

-микробиологический мониторинг производственной среды.

Таким образом, целью микробиологических исследований является установление факта наличия или отсутствия возбудителей (микроорганизмов) в организме больного и на объектах окружающей среды, а также их идентификация (определение видовой принадлежности). Одной из задач микробиологических исследований в клинической практике является установление чувствительности выделенных микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Все методы исследования при диагностике инфекционных болезней и идентификации бактерий можно разделить на 2 группы:

1.Методы с выделением чистой культуры бактерий на питательных

средах.

2.Методы без выделения чистой культуры бактерий.

Золотым стандартом микробиологии являются исследования, предусматривающие выделение чистой культуры бактерий и их последующая идентификация (определение родовой и видовой принадлежности). Чистая культура – это популяция микроорганизмов одного вида, полученная из изолированной колонии микробов с плотной питательной среды.

Идентификация без выделения чистой культуры микроорганизмов необходима для детекции возбудителей непосредственно в биологическом материале, что позволяет проводить экспресс-диагностику заболеваний, а также выявлять некультивируемые микроорганизмы. Для осуществления идентификации бактерий без выделения чистой культуры используют генетические и серологические методы.

К генетическим методам относятся ПЦР, ЛЦР, гибридизация, секвенирование. Эти методы являются перспективными для идентификации любых микроорганизмов и определения их чувствительности к противомикробным препаратам, что обусловлено крайне высокой чувствительностью методов и быстротой получения результатов. Эти методы в настоящее время широко используются для идентификации длительно культивируемых бактерий (например, микобактерий туберкулёза), облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий), а также вирусов (в частности, ВИЧ, возбудителей вирусных гепатитов).

6

К серологическим методам относятся РИФ, ИФА, иммуноблоттинг. Наибольшее распространение эти методы получили для идентификации возбудителей бактериальных инфекций и вирусных антигенов.

В последние годы широкое распространение получают методы массспектрометрии, газовой и жидкостной хроматографии и сочетание методов массспектрометрии и хроматографии.

Классическая схема диагностики инфекционных болезней включает следующие этапы:

-отбор исследуемого материала;

-приготовление микроскопического препарата, его окраска по Граму и микроскопирование с иммерсией;

-посев исследуемого материала на плотную питательную среду для получения изолированных колоний;

-микроскопическое исследование выросшей культуры и пересев материала из изолированных колоний для накопления культуры (получение чистой культуры);

-идентификация чистой культуры, то есть установление видовой принадлежности микроба путем изучения биохимических свойств чистой культуры,

еечувствительности к бактериофагам и антибиотикам;

-выдача заключения.

При идентификации бактерий используют следующие показатели:

-фенотипические (морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические, антигенные свойства);

-генотипические (соотношение гуанина и цитозина, плазмидный профиль, рестрикционный анализ);

-филогенетические (анализ РНК-последовательностей, секвенирование 16S

и23S рРНК).

Классическими методами микробиологических исследований являются следующие:

-микроскопический метод – изучение морфологических особенностей (форма клеток) и тинкториальных свойств (отношение к красителям) микроорганизмов;

-культуральный (бактериологический, микологический) метод –

изучение культуральных (характер роста микробов на питательных средах) и биохимических свойств (изучение каталазной и оксидазной активности, ферментативной активности микробов: сахаролитических, протеолитических, липолитических свойств бактерий, реже – тесты ассимиляции азота, определение уреазной активности и активности отдельных ферментов), чувствительности к бактериофагам и антибиотикам;

-биологический метод – изучение влияния микробов на организм лабораторных животных (определение вирулентности и токсигенности бактерий, биопробы);

-иммунологический (серологический и аллергологический) метод –

изучение антигенных свойств бактерий и реакций организма на эти антигены;

-молекулярно-генетический метод – обнаружение в исследуемом материале фрагментов генома бактерий.

7

Однако по фенотипическим признакам ошибочно идентифицируется до 3050% культур. Основные недостатки фенотипической идентификации бактерий:

-ограниченность набора исследуемых признаков;

-высокая изменчивость свойств микроорганизмов;

-малая информативность;

-высокая трудоемкость;

-низкая стандартизация;

-высокая стоимость исследования;

-длительность исследования;

-продолжительное культивирование (некультивируемость) некоторых возбудителей.

Поэтому основными тенденциями развития современных микробиологических исследований являются автоматизация; централизация; внедрение в практику молекулярно-генетических и экспресс-методов исследования (point of care) “у постели больного”.

За последние годы возросли возможности автоматизированных микробиологических исследований. Все шире используются методы, позволяющие

вкороткие сроки получать окончательный ответ. Эти методы характеризуются высокой воспроизводимостью, точностью и приемлемой стоимостью оборудования.

При выделении и идентификации бактерий ориентируются на следующие регламентирующие документы:

-“Приказ об унификации микробиологических методов исследования №535 от 1985 г.”;

-ГОСТ Р 53079.4-2008 Группа Р20 “Национальный стандарт Российской Федерации. Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований”;

-МУК 4.2.2886-11 “Идентификация микроорганизмов и определение чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы для биохимического анализа”;

-МУК 4.2.1890-04 “Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам”;

-рекомендации по выделению и идентификации некоторых возбудителей, издаваемые Межрегиональной Ассоциацией Клинической Микробиологии и Антимикробной Химиотерапии (МАКМАХ).

Кроме классических методов все более широкое распространение получают современные полуавтоматические и автоматические методы исследования.

8

1. Классификация микроорганизмов по степени патогенности и группы риска микробиологических лабораторий

Биологическая опасность – это отрицательное воздействие биологических патогенов любого уровня и происхождения (от прионов и микроорганизмов до многоклеточных паразитов), создающих опасность в медико-социальной, технологической, сельскохозяйственной и коммунальной сферах. Биологическую опасность или риск для здоровья людей и окружающей среды в микробиологических лабораториях может представлять исследуемый материал, содержащий микроорганизмы или токсины биологического происхождения. В лабораториях могут присутствовать как патогенные, так и непатогенные для человека микробы.

Патогенные микроорганизмы, токсины и паразиты, вызывающие заболевания человека, животных, растений, деградацию материалов, резкое ухудшение качества окружающей среды определяются как опасные биологические агенты.

Поэтому важным направлением микробиологических исследований является обеспечение безопасности проводимых лабораторных работ. Биологическая безопасность – это предотвращение ущерба и достижение защищенности личности, общества и государства от потенциальных и реальных биологических угроз. Поэтому основными мероприятиями биологической защиты являются обеспечение охраны, контроля и учета биологических агентов и токсинов внутри лабораторий с целью предотвращения их утраты, кражи, использования не по назначению, несанкционированного доступа или преднамеренного несанкционированного высвобождения.

В Российской Федерации принята “Классификация микроорганизмов – возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности”. По степени патогенности (биологической опасности) в Российской Федерации все микроорганизмы разделены на 4 группы:

I группа – возбудители особо опасных инфекций (Yersinia pestis, геморрагические лихорадки Ласса, Эбола и др.);

II группа – возбудители высоко контагиозных эпидемических заболеваний человека бактериальной, грибковой и вирусной этиологии (Bacillus anthracis,

Brucella abortus, Francisella tularensis, возбудители сыпного тифа, лихорадки Скалистых гор, бластомикоза и др.);

III группа – возбудители инфекционных болезней, выделяемых в самостоятельные нозологические группы (Bordetella pertussis, Clostridium botulinum, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria meningitidis и др.);

IV группа – условно-патогенные микробы (возбудители оппортунистических инфекций – Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Escherichia coli и др.) и

непатогенные микроорганизмы.

Аттенуированные штаммы возбудителей I-II групп патогенности относятся к микроорганизмам III группы патогенности, а аттенуированные штаммы III-IV групп

– к IV группе патогенности.

Эта классификация разработана в соответствии с рекомендациями ВОЗ, но отличается от классификации ВОЗ обратным порядком (отечественная I группа

9

микроорганизмов соответствует IV группе патогенных биологических агентов по классификации ВОЗ). Классификация микроорганизмов по группам риска ВОЗ выглядит следующим образом.

Группа риска 1 – отсутствие или низкая индивидуальная и общественная опасность. Микроорганизмы этой группы потенциально не являются возбудителями болезней человека или животных.

Группа риска 2 - умеренная индивидуальная опасность, низкая общественная опасность. К этой группе относятся патогенные микроорганизмы, которые могут вызывать заболевание у человека или животных, но не представляют серьезного риска для лабораторного персонала, населения, домашнего скота или окружающей среды. Неосторожность в лаборатории может вызвать серьезную инфекцию, однако существуют доступные лечебные и профилактические меры и риск ее распространения ограничен.

Группа риска 3 – высокий индивидуальный и низкий общественный риск. Патогенный агент этой группы обычно вызывает серьезное заболевание человека или животных, однако, как правило, не распространяется от больного к здоровому. Существуют эффективные лечебные и профилактические меры.

Группа риска 4 – высокий индивидуальный и общественный риск. Патогенный агент этой группы обычно вызывает серьезные заболевания у человека или животных и легко распространяется от больного к здоровому прямо или опосредованно. Эффективных лечебных мер в большинстве случаев нет.

ВРоссийской Федерации работа с материалом, содержащим микроорганизмы I-II групп патогенности, регламентируется Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.3118-13 “Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)”.

Исследования с микроорганизмами I-II групп патогенности проводятся в специальных режимных микробиологических лабораториях обученным персоналом. Обязательным условием является вакцинация персонала (при наличии соответствующих вакцин). При выполнении работ требуется строгое соблюдение мер безопасности с целью предупреждения случаев внутрилабораторного заражения, выноса инфекции за пределы лаборатории и недопущения контаминации окружающей среды.

Работа с материалом, содержащим микроорганизмы III-IV групп патогенности, регламентируется Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 “Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней”.

Эти исследования осуществляются в микробиологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений и подобных лабораториях других организаций.

Вопросы биологической безопасности при обращении с потенциально инфекционными материалами изложены в “Практическом руководстве по биологической безопасности в лабораторных условиях”, периодически издаваемом Всемирной Организацией Здравоохранения. В настоящее время действует Третье Издание этого Руководства.

Взависимости от выполняемых исследований, микробиологические лаборатории подразделяют на диагностические, производственные и научно-

10

исследовательские. В соответствии с типами исследуемых микроорганизмов выделяют бактериологические, вирусологические, микологические и протозоологические лаборатории.

Соответствующие санитарно-эпидемиологические правила устанавливают требования к организационным, санитарно-противоэпидемическим (профилактическим) мероприятиям, направленным на обеспечение личной и общественной безопасности и защиту окружающей среды при работе с патогенными микроорганизмами. Биологическая безопасность предусматривает порядок осуществления лабораторных исследований и специальное оснащение микробиологических лабораторий, которые защищают персонал лабораторий и окружающую среду при работе с потенциально опасными микроорганизмами. Уровень мер предосторожности, необходимых при работе с потенциально опасными биологическими агентами, представляет собой уровень биобезопасности.

В зависимости от степени патогенности (биологической опасности) микроорганизмов микробиологические лаборатории подразделяют на категории. По номенклатуре ВОЗ выделяют 3 категории микробиологических лабораторий:

-базовые (основные или общего типа), оборудованные различными защитными устройствами;

-режимные (изолированные) или лаборатории удержания;

-лаборатории особого режима (максимально изолированные), или лаборатории максимального удержания.

Указанные категории микробиологических лабораторий в свою очередь подразделяют на 4 группы риска (таблица 1):

I группа – базовые (основные) лаборатории с низким индивидуальным и общественным риском (BSL-1, помещения, где проводят работы с микроорганизмами IV групп патогенности);

II группа – базовые (основные) лаборатории с умеренным индивидуальным и ограниченным общественным риском (BSL-2, помещения, где проводят работы с микроорганизмами II-IV групп патогенности);

III группа – режимные лаборатории (изолированные) с высоким индивидуальным и низким общественным риском (BSL-3, помещения, где проводят работы с возбудителями II группы патогенности);

IV группа – лаборатории особого режима (максимально изолированные) с высоким индивидуальным и общественным риском (BSL-4, помещения, в которых проводят работы микроорганизмами I группы патогенности).

Таблица 1 – Группы риска микробиологических лабораторий