Методы исследования в медицинской бактериологии

51

азотсодержащих соединений, превращая аммиак в азот. При свежем фекальном загрязнении нитрификаторов не будет, поскольку отсутствует субстрат для их развития. В ходе жизнедеятельности микроорганизмов, разлагающих органические вещества, образуется аммиак, что приводит к накоплению нитрификаторов. Через 4-5 месяцев после фекального загрязнения БГКП в почве уже не обнаруживаются, а CI. perfringens еще обнаруживается в титре 0,01. Следовательно, CI. perfringens свидетельствует о давнем фекальном загрязнении. Выявление в почве бактерий рода Proteus свидетельствует о загрязнении ее органическими веществами животного происхождения или фекалиями людей.

Термофильные микроорганизмы попадают в почву с перепревшим навозом или компостом. В чистых почвах термофилов не обнаруживают. Термофильные бактерии целесообразно выявлять для выяснения характера и давности загрязнения почвы органическими веществами. Свежий навоз, сточные воды обычно содержат много БГКП, но мало термофильных бактерий. По мере разложения органических веществ количество термофилов увеличивается.

Результаты, полученные при санитарно-микробиологическом анализе почвы, позволяют оценить также степень ее эпидемической опасности (таблица

5).

Таблица 5 – Оценка степени эпидемической опасности почвы

Для оценки активности почвенной микрофлоры используют показатель биологической активности почвы. Биологическую активность почвы определяют следующими способами:

-подсчетом общего количества почвенных микроорганизмов;

-определением количества отдельных физиологических групп микробов, например, нитрифицирующих или целлюлозоразлагающих бактерий;

-определением выделяемого почвой диоксида углерода - основной биохимический способ определения биологической активности почвы. Чем

интенсивнее выделяется углекислый газ из почвы, тем активнее происходят в ней биологические процессы.

Выделение углекислого газа из почвы в приземный слой атмосферы называют дыханием почвы. Интенсивность дыхания почвы зависит от ее свойств, гидротермических условий, характера растительности, агротехнических мероприятий. Выделение углекислого газа почвой усиливается при ее окультуренности. Уменьшение выделения углекислого газа почвой свидетельствует об ухудшении поступления кислорода в почву и способствует образованию токсичных веществ.

52

Периодичность санитарно-микробиологического контроля почвы зависит от контролируемых объектов, но не реже 1 раза в год. При изучении динамики самоочищения почвы на загрязненных территориях пробы берут в течение первого месяца после загрязнения еженедельно, в последующие месяцы - 1 раз в месяц в течение вегетационного периода до завершения активной фазы самоочищения.

4.2. Отбор и анализ проб воды

При санитарно-микробиологической оценке воды ориентируются на следующие руководящие документы:

-ГОСТ Р 51593-2000 “Вода питьевая. Отбор проб”;

-МУК 4.2.1884-04 “Санитарно-микробиологический и санитарнопаразитологический анализ воды поверхностных водных объектов”;

-МУК 4.2.1018-01 “Методические указания по санитарномикробиологическому анализу питьевой воды”;

-СанПиН 2.1.4.1074-01 “Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества”;

-СанПиН 2.1.4.1175-02 “Микробиологические нормативы качества воды нецентрализованного водоснабжения (колодцев, скважин, родников)”.

Показатели санитарно-микробиологического состояния питьевой воды:

-общее микробное число (ОМЧ);

-бактерии семейства Enterobacteriaceae и термотолерантные колиформные бактерии;

-споры сульфитредуцирующих клостридий;

-колифаги;

-патогенные бактерии кишечной группы.

Определение общего микробного числа (ОМЧ) в питьевой воде проводят следующим образом. Из каждой пробы делают посев не менее 2 объемов по 1 мл. В стерильную чашку Петри вносят 1 мл пробы воды и вливают 8-12 мл расплавленного и остуженного до 45-49ОС питательного агара. Затем содержимое чашек перемешивают. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре 37ОС в течение 24 часов. После этого подсчитывают все выросшие на обеих чашках колонии, суммируют их и делят на 2. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой воды. Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе отмечают “сплошной рост”.

ОМЧ при оценке качества питьевой воды позволяет оценить уровень не только фекального загрязнения, но и загрязнения из других источников (например, промышленных сбросов). Неожиданное увеличение ОМЧ (даже в пределах норматива), выявленное повторно, служит сигналом для поиска причины загрязнения. Этот показатель незаменим также для срочного обнаружения в питьевой воде массивного микробного загрязнения неизвестной природы.

53

Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий

проводят методом мембранной фильтрации или титрационным методом. Общие колиформные бактерии (ОКБ) представляют собой грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных содержащих лактозу средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37ОС в течение 24-48 часов.

Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками, но кроме того способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44ОС в течение 24 часов.

Мембранный метод основан на фильтрации определенного объема воды через мембранные фильтры, инкубировании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой (среде Эндо) при температуре 37ОС в течение 24 часов и идентификации выросших колоний по культуральным и биохимическим свойствам. При исследовании используют 3 объема воды по 100 мл. Типичные лактозоположительные колонии (темно-красные, красные с металлическим блеском или без него) исследуют на наличие оксидазной активности, отношение к окраске по Граму и ферментацию лактозы до кислоты и газа. Указанные признаки определяют с помощью тестов, регламентированных Методическими указаниями.

Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37ОС с образованием кислоты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44ОС с образованием кислоты и газа.

Титрационный метод основан на накоплении бактерий при посеве определенного объема воды в жидкую питательную среду с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификации колоний по культуральных и биохимическим свойствам. Количество исследуемых проб и объем исследуемой воды регламентируется Методическими указаниями. В качестве жидкой питательной среды используют лактозо-пептонную среду, в качестве плотной питательной среды – агар Эндо. Идентификация колоний производится аналогично исследованиям при использовании мембранного метода.

Обнаружение в питьевой воде бактерий семейства Enterobacteriaceae указывает на потенциальную эпидемическую опасность такой воды. Показатель “бактерии семейства Enterobacteriaceae” - основной нормируемый показатель, обеспечивающий наиболее надёжный контроль присутствия в воде практически всех представителей кишечных бактерий.

Термотолерантность быстро утрачивается, поэтому обнаружение бактерий с таким свойством свидетельствует о недавнем попадании в воду кишечных бактерий (свежее фекальное загрязнение). Бактерии семейства Enterobacteriaceae и термотолерантные бактерии должны отсутствовать в 300 мл питьевой воды.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий производят путем выращивания посевов в железо-сульфитном агаре в анаэробных условиях и последующего подсчета количества колоний черного цвета. Сульфитредуцирующие клостридии представляют собой спорообразующие анаэробные палочковидные

54

микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре 44ОС в течение 16-18 часов. Количество проб и объем исследуемой воды регламентируется Методическими указаниями. Перед посевом воду прогревают при температуре 75ОС в течение 15 минут. Исследование проводят фильтрационным методом или прямым посевом воды в питательную среду.

Споры сульфитредуцирующих клостридий более устойчивы к обеззараживанию и действию неблагоприятных факторов окружающей среды, чем другие индикаторные бактерии. На основании этого свойства показатель рекомендован для оценки эффективности технологических процессов очистки воды. Особое значение этот показатель имеет при оценке первичного хлорирования, так как хлорирование инактивирует практически все индикаторные бактерии. Обнаружение клостридий в воде перед поступлением в распределительную сеть указывает на недостаточную очистку и на то, что устойчивые к обеззараживанию патогенные микроорганизмы, вероятно, не погибли при очистке. Споры сульфитредуцирующих клостридий должны отсутствовать в 20 мл исследуемой питьевой воды.

Определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительном накоплении фагов в среде обогащения на культуре E. coli и последующем выявлении зон лизиса (просветления) газона кишечной палочки на питательном агаре. Исследования проводят по методике, изложенной в Методических указаниях, прямым или титрационным методом. В 100 мл исследуемой воды должны отсутствовать бляшкообразующие единицы (БОЕ) колифагов.

Для определения микроорганизмов в воде используют приборы вакуумного фильтрования (рисунок 44), снабженные мембранными фильтрами. После фильтрования фильтры извлекают и инкубируют на поверхности плотной питательной среды.

Рисунок 44 – Прибор вакуумного фильтрования.

Принцип метода мембранных фильтров представлен на рисунке 45.

55

Рисунок 45 – Принцип метода мембранных фильтров.

Требования к воде централизованных систем водоснабжения представлены в таблице 6.

Таблица 6 – Требования к питьевой воде

Требования к воде открытых источников, плавательных бассейнов, сточным водам также регламентированы соответствующими нормативными документами.

4.3. Отбор и анализ проб воздуха

Санитарно-микробиологические показатели воздуха нормируются только для закрытых помещений в зависимости от их типа и назначения. В таблице 7 представлены критерии оценки воздуха жилых помещений.

Исследование воздуха на наличие микроорганизмов осуществляют седиментационным или фильтрационным методами.

Седиментационный метод Коха предусматривает использование чашек Петри с питательной средой. Открытую чашку помещают на горизонтальную поверхность на уровне стола на определенное время. Затем чашку закрывают и инкубируют в термостате. Ориентировочно по количеству выросших колоний судят о чистоте воздуха. Воздух оценивается чистым при количестве колоний менее 250, средне загрязненный – при количестве 250-500 колоний и загрязненный – при числе колоний более 500. Для выявления стафилококков используют желточно-солевой агар (ЖСА), стрептококков – кровяной агар (КА), грибов – среду Сабуро.

С помощью седиментационного метода Коха можно определить количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Для этого используют перерасчет по формуле В.Л. Омелянского, с учетом того, что за 5 минут на площади 100 см2 оседает такое количество бактерий, которое находитсяФормулав 10 воздухаОмелянского:

Ах 100 х 100

Х= ————————

75 см2

100 – коэффициенты перевода на 100 см2 поверхности и 1 м3 объема.

Аспирационный метод основан на принудительном осаждении микроорганизмов на поверхности плотной питательной среды или в улавливающей жидкости. С этой целью используют аппарат Кротова, бактериоуловитель Речменского, прибор ПОВ-1 и другие приборы-аспираторы.

Принцип работы аппарата Кротова для бактериологического исследования воздуха и его аналога пробоотборника бактериологического Тайфун-Р40 (М) (рисунок 46) основан на просасывании воздуха через клиновидную щель в крышке аппарата. Микроорганизмы, находящиеся в воздухе, попадают внутрь камеры и прилипают к плотной питательной среде в открытой чашке Петри, находящейся под крышкой аппарата.

58

а б в

Рисунок 48 – Пробоотборники воздуха: а - Bio Sas Super, б - Mas 100, в – Sampl Air Lite. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для помещений разного функционального предназначения установлены определенные требования к уровням бактериальной обсемененности воздуха. В частности, СанПиН 2.1.3.1375-03 регламентирует уровни бактериальной обсемененности воздуха лечебных учреждений в зависимости от их функционального назначения и класса чистоты (таблица 8).

Таблица 8 – Допустимые уровни бактериальной обсемененности воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их функционального

назначения и класса чистоты

59

Обеззараживание воздуха закрытых помещений проводят разными способами, в том числе с использованием газов, аэрозолей или УФЛаэроионизаторов.

60

5. Классические методы выделения и идентификации бактерий

5.1. Бактериоскопическое исследование

5.1.1. Оборудование рабочего места для микроскопирования

Рабочее место для микроскопирования должно быть оснащено всем необходимым для приготовления препаратов живых или фиксированных микробов, проведения непосредственно микроскопии и предотвращения контаминации изучаемыми микробами окружающей среды. Микроскоп должен располагаться на рабочем столе, устойчивом к сотрясению. Его покрывают материалом (стекло, пластик), стойким к дезинфектантам. Рабочее место должно иметь хорошее искусственное освещение. К работе приступают лишь после проверки полной готовности рабочего места (рисунок 49).

Рисунок 49 – Оборудование рабочего места для микроскопирования. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для приготовления препарата для микроскопирования на рабочем столе кроме микроскопа должны находиться следующие принадлежности и материалы: штатив, горелка (спиртовка), спички, предметные и покровные стекла в склянке со спиртом, бактериологическая петля, бактериологическая игла, дезраствор, вата, салфетки, бутыль с сифоном и с дистиллированной водой для промывания препаратов, мостик, чашка для окраски препаратов и сбора мусора (кристаллизатор), кювет с ковриком, склянки с красителями и фиксирующими жидкостями, карандаши и другие необходимые материалы. Принадлежности рабочего места для приготовления препаратов для микроскопических исследований представлены на рисунках 50-53.