Методы исследования в медицинской бактериологии

141

испытуемой суточной бульонной культуры наносят на МПА и шпателем распределяют по поверхности агара. Затем чашку условно делят на квадраты. В каждый квадрат наносят по капле суспензий разных бактериофагов. После суточного культивирования в термостате учитывают результаты. При соответствии бактерий и фага обнаруживаются зоны лизиса (рисунок 146).

Рисунок 146 – Фаготипирование бактерий по методу Фишера. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Метод Фюрта используется для типирования нескольких неизвестных бактерий с помощью одного известного бактериофага. При выполнении этого теста в расплавленный и остуженный до 45-50ОС МПА добавляют суспензию известного бактериофага и тщательно перемешивают. Полученную смесь разливают в чашки Петри. Каждую чашку условно делят на несколько секторов, в которые высевают штрихом разные исследуемые культуры. Чашки инкубируют в термостате, после чего учитывают результаты. Рост культуры будет отсутствовать в том секторе, в котором бактерии и фаг соответствуют друг другу (рисунок 147).

Рисунок 147 – Фагоидентификация бактерий по методу Фюрта. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Фаготипирование часто используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). При этом

142

выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

Присутствие каких-либо микроорганизмов в исследуемой пробе (вода, пищевые продукты) можно установить с помощью бактериофагов. Этот прием основан на специфичности действия бактериофагов: бактериофаг E. coli лизирует только кишечную палочку, холерный бактериофаг вызывает лизис только холерного вибриона и т. д. Для установления присутствия определенных бактерий в исследуемую пробу добавляют известное количество специфического фага. При наличии гомологичных бактерий фаг размножается, в результате чего нарастает его титр (количество). Следовательно, реакция нарастания титра фага основана на увеличении количества фага при его контакте с возбудителем непосредственно в исследуемом материале. Реакцию нарастания титра фага используют при диагностике дизентерии и брюшного тифа, для выявления бактерионосительства при брюшном тифе, для обнаружения брюшнотифозных и дизентерийных бактерий

вводе и молоке, для обнаружения дизентерийных микробов на предметах внешней среды, для выявления чумного микроба и холерного вибриона в воде.

Реакция нарастания титра фага проводится следующим образом. К исследуемому материалу добавляется определенное количество индикаторного бактериофага. Смесь инкубируют при температуре 37ОС в течение 4,5-16 часов. Затем пробу прогревают при температуре 58ОС в течение 30 минут и определяют количество (титр) бактериофага методом агаровых слоев по Грациа. Для этого в чашку Петри наливают слой МПА. После застывания на этот слой наливают 2 мл расплавленного и охлажденного до 45ОС полужидкого (0,7%) агара, в который предварительно добавляют каплю бактериальной суспензии и определенный объем суспензии бактериофага. После застывания верхнего слоя агара чашку инкубируют

втермостате при температуре 37ОС в течение 18-24 часов (рисунок 148).

Рисунок 148 – Определение количества фаговых частиц методом агаровых слоев по Грациа. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

143

Бактерии размножаются внутри верхнего слоя агара, образуя сплошной непрозрачный фон, на котором хорошо видны негативные колонии фага в виде стерильных пятен. Считается, что каждая негативная колония образуется за счет размножения одной фаговой частицы. Метод Грациа позволяет рассчитывать концентрацию (титр) фага в исходной суспензии (рисунок 149).

Рисунок 149 – Негативные колонии бактериофага в агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Количества фаговых частиц выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ/мл). Титр фага в исходной суспензии рассчитывают по формуле:

N = y/vx,

где: N - титр фага;

y - количество негативных колоний;

v - объем использованного фильтрата фага; х - разведение суспензии фага.

Например, если 0,1 мл фильтрата фага в разведении 10-5 образует 250 негативных колоний, то титр равен 250:0,1 x 10-5 = 2,5 x 108 БОЕ/мл.

144

7. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

Определение чувствительности бактерий к антибиотикам проводят согласно утвержденным документам (стандартам или приказам), которые регламентируют процедуру определения антибиотикорезистентности микроорганизмов. В Российской Федерации существуют соответствующие методические указания по определению антибиотикорезистентности (МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания), в США и Европе – стандарты и рекомендации Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI, до 2005 г. - National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS). В

Российской Федерации большую исследовательскую и образовательную работу по вопросам клинической микробиологии и антимикробной резистентности осуществляет Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной терапии (МАКМАХ).

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам показано в следующих случаях:

-выявление чувствительности бактерий к новому антибиотику, рекомендованному к применению;

-периодический мониторинг распространения антибиотикорезистентности в отдельных регионах;

-обоснование адекватной антибиотикотерапии у некоторых пациентов (при выделении бактерий из первично стерильных тканей и органов, при изоляции возбудителей, резистентных к используемым антибиотикам, при отсутствии опыта лечения новых инфекций).

При тестировании чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используют чистую культуру бактерий. Определение чувствительности без выделения чистой культуры возможно только в исключительных случаях. При этом исследование повторяют после выделения чистой культуры бактерий.

При изучении чувствительности бактерий к антибиотикам используют следующие специфические термины.

Минимальная ингибирующая или минимальная подавляющая концентрация (МИК или МПК) - наименьшая концентрация антибиотика, которая подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in vitro (в жидких или на плотных питательных средах) в стандартных условиях постановки опыта. МПК выражается в мкг/мл (мг/л) или ед/мл.

Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) - наименьшая концентрация антибиотика, которая при исследовании in vitro вызывает гибель 99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определённого периода времени.

Чувствительный микроорганизм – это микроорганизм, который не имеет механизмов резистентности к данному антибиотику. Его рост на питательной среде прекращается при использовании антибиотика в терапевтической дозе.

Умеренно-резистентный (умеренно-устойчивый) микроорганизм - это микроорганизм, рост которого на питательной среде прекращается только при использовании антибиотика в повышенной дозе. Лечение инфекций, вызываемых

145

умеренно-резистентными микроорганизмами, в случае отсутствия альтернативных препаратов, проводится высшей (максимальной терапевтической) дозой антибиотика.

Резистентный (устойчивый) микроорганизм - это микроорганизм,

который имеет механизмы резистентности к данному антибиотику. Его рост на питательной среде прекращается лишь при использовании очень высоких концентраций препарата, которые нельзя создать в организме из-за их высокой токсичности. При лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом, клинический эффект от терапии отсутствует даже при использовании высшей дозы антибиотика. При этом могут наблюдаться побочные эффекты от действия антибиотика.

В настоящее время на практике используются следующие методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам:

-метод серийных разведений антибиотиков в жидких средах;

-метод серийных разведений антибиотиков в плотных средах;

-диффузионный метод классический;

-диско-диффузионный метод;

-комбинированный метод (Е-тест).

Метод серийных разведений в жидких средах предусматривает определение минимальной ингибирующей (подавляющей) рост микроорганизмов концентрации антибиотиков. Для этого готовят 8-12 двукратных серийных разведений антибиотика и суспензию исследуемого микроорганизма с концентрацией микробных клеток 106 КОЕ/мл. В жидкие среды с серийными разведениями антибиотиков вносят исследуемую культуру в соотношении 1:1 (посевная доза – 5·105 КОЕ), инкубируют посевы в течение 10-18 часов при температуре 37°С, и учитывают результаты визуально или нефелометрически. В качестве контроля используют пробирку с питательной средой без антибиотика. МПК соответствует наибольшему разведению препарата, тормозящему рост культуры (рисунок 150).

Рисунок 150 – Определение МПК методом разведения в жидкой питательной среде.

Иногда в среду культивирования добавляют глюкозу и индикатор, что позволяет учитывать результаты также по изменению окраски среды. Этот метод

146

позволяет установить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) или минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата для конкретного возбудителя. В качестве питательной среды используют МПБ или другую среду, соответствующую питательным потребностям возбудителя.

Серийные разведения антибиотиков в жидких средах можно проводить микрометодом в лунках планшетов (рисунок 151), используя в планшете один антибиотик и разные культуры или разные антибиотики и одну культуру. Именно этот принцип используется в тех микробиологических анализаторах, которые предусматривают возможность определения чувствительности исследуемой культуры к антибиотикам.

Рисунок 151 – Определение чувствительности бактерий к антибиотикам микрометодом серийных разведений в лунках планшета (концентрация антибиотика убывает сверху вниз; 1-11 – номера культур). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Метод серийных разведений в плотных средах аналогичен предыдущей процедуре, но проводится с использованием плотных питательных сред. Для проведения исследований готовят 8-12 серийных двукратных разведений антибиотиков в пробирках, содержащих охлажденную агаровую среду. Содержимое пробирок перемешивают и переносят в чашки Петри до застывания агара. Затем на поверхность агара проводят посев исследуемой культуры в количестве 1-2 мкл (посевная доза 1-2·104 КОЕ). Посевы инкубируют в течение 18-20 часов при температуре 35-37°С. МПК антибиотиков устанавливают по отсутствию роста культуры на агаре с определенной концентрацией антибиотика.

Диффузионные методы менее чувствительны, чем методы стандартных разведений, но проще в исполнении. На практике их применяют чаще. Эти методы являются качественными и позволяют определять чувствительность бактерий к нескольким антибиотикам одновременно.

Классический диффузионный метод осуществляется следующим образом. В чашки Петри вносят тонкий слой (4-5 мм) агара. После застывания на поверхность агара наносят микробную взвесь и равномерно распределяют по поверхности. После подсушивания чашек в термостате в агаре пробивают лунки диаметром 5 мм и в

149

а б в Рисунок 156 – Диспенсеры (а) для размещения гексадисков (б) и октодисков (в) при

определении чувствительности бактерий к антибиотикам. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Зоны задержки роста культур вокруг дисков измеряют с помощью линейки. Полученные размеры зон сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными в инструкции, после чего микроорганизмы относят к той или иной группе (чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным). Показатели активности основных антибиотиков, определяемые методом стандартных индикаторных дисков, представлены в таблице 18.

Таблица 18 – Показатели активности основных антибиотиков, определенные методом стандартных индикаторных дисков

В случае, когда используются антибиотики, не указанные в представленной таблице, используют универсальную оценочную шкалу (таблица 19).

Таблица 19 – Ориентировочная (универсальная) шкала оценки чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при использовании диско-

диффузионного метода