Методы-исследования

1

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы исследования можно разделить на две большие группы:

1.по объекту исследования

2.по задачам

По объекту исследования:

I.Методы исследования живых клеток и тканей

1.непосредственно в организме (in vivo)

2.в культуре клеток и ткани – в пробирке (in vitro)

3.суправитальное исследование

-суправитальное - исследование живых клеток, выделенных из организма

II. Методы исследования фиксированных клеток и тканей

1.светооптическая микроскопия

2.гистохимическое исследование - выявление в срезах веществ разной химической природы (ДНК, РНК, гликоген, импрегнация серебром, эластические волокна и т.д.)

3.иммуногистохимическое исследование – с применением антител к исследуемым антигенам

4.электронно-микроскопические исследования - исследование клеточных ультраструктур

По задачам:

I.Качественные методы - выявление структур

Методы:

1.светооптический

2.электронно-микроскопический

3гистохимический

4иммуногистохимический

II.Количественные методы – изучение размеров или числа структур

Методы:

1.Морфометрический (количественная электронная микроскопия, количественная гистохимия)

2.иммунофенотипирование

3.цитогенетический

4.авторадиографический

5.ДНК-цитометрия

1

2

Светооптический метод (традиционная качественная гистология) Две части:

1.приготовление гистологических препаратов

2.микроскопия гистологических препаратов

Этапы приготовления гистологических препаратов:

I.врачебные

II. лаборантские

Врачебный этап:

1.забор материала -

-максимально должен отражать изучаемый объект (столько кусочков, сколько необходимо)

-как можно более свежий

-кусочек не более 1 куб. см

-щадящее - острый инструмент, не сдавливать

2.маркировка

-простым карандашом ФИО, № истории болезни

3.фиксация

-цель – предотвратить разложение ткани

-закрепить прижизненные структуры

-формалин - 10%, нейтральный

-объем фиксатора должен быть в 20-100 раз больше фиксируемого кусочка

-время фиксации – не менее 12 часо до

нескольких суток (для иммуногистохими - не более 24 часов)

II.лаборантские

4. проводка материала

а. промывка - отмывают от формалина

-в проточной воде до 1 часа б. обезвоживание

-обеспечивает проникновение парафина

-проводка по спиртам восходящей крепости до абсолютного спирта (от 60 до 100 градусов)

в. уплотнение - парафиновая заливка материала - заливка в расплавленный до 56 гр парафин

г. формирование блока - когда парафин застыл, вырезают кусочек ткани

2

3

- насаживают на деревянную или пластмассовую основу

5.приготовление срезов

-на микротомах

1.санные

2.роторные (серийные срезы)

3.замораживающие (срочные исследования)

6.окрашивание среза

красители:

1.основные - структуры ими окрашивающиеся называют базофильными (ядро – гематоксилином – в фиолетовый цвет)

2.кислые - структуры ими окрашивающиеся называются - оксифильными или ацидофильными (цитоплазма – эозином – розовый цвет)

3.специальные

жир - судан Ш - оранжевый эластические волокна - орсеиномкоричневые нервная ткань - соли серебра – черная

(импрегнация)

7 заключение среза

задачи:

- сохранение среза, достигается:

-изоляция от внешней среды

-удаление воды (спирты)

реализация:

-капля канадского (пихтового) бальзама

-покровное стекло

Виды микропрепаратов:

1.гистологические срезы тканей органов

2.мазки (кровь человека)

3.отпечатки ( с опухоли)

4.пленки (РСТ)

Морфометрия

- метод определения числа и размеров структур

3

4

Разновидности:

1.ручная морфометрия

2.автоматизированная морфометрия

Виды морфометрических исследований:

1.подсчет индексов

2.измерение размеров структур

Индексы:

а. митотический индекс (ИМ) - число митозов на 100 (1000) клеток б. индекс меченых ядер (ИМЯ)– при радиоавтографии – %

клеток, включивших исследуемое вещество, меченое радиоизотопной меткой г. статмокинетический индекс (СКИ) - накопление митозов в

течение определенного времени после разрушения веретена деления (колхицин)

в. индекс апоптоза – частоты гибели клеток

Измерение размеров структур

1.окулярной микролинейкой (или окуляр-микрометра)

-позволяет получать абсолютные значения размеров структур

-в мкм

2.морфометрических сеток

-позволяет определять относительные показатели – долю объема, занимаемую структурой в срезе

-в %

Автоматизированные системы обработки изображений

Состоят из трех частей:

1.воспринимающая часть - сканирующий микроскоп

2.регистрация сигнала – фотометрический (ФЭУ) или видеокамера

3.ЭВМ (электронно-вычислительная машина) – цифровые массивы или гистограммы распределения изучаемого признака.

Задачи:

1.Морфометрическая - оценка морфометрических показателей (количество объектов в определенной площади среза, размеры объектов, отношения показателей). Регистрация сигнала - видеокамера.

4

5

2.Денситометрическая - оценка количества вещества в структуре (содержания ДНК в ядре клетки и т.д.). Регистрация сигнала – фотоэлектронный умножитель.

Пример морфометрической задачи - изучение ядерноцитоплазматического отношения.

Ядерно-цитоплазматическое отношение –

-относительный показатель

-отношение объема (размера) ядра клетки к объему (размеру) ее цитоплазмы

-является величиной постоянной (константой) для каждого вида ткани

-константа достигается после окончания процесса дробления в эмбриогенезе (процесс дробления осуществляется до достижения клетками данной ткани определенного ядерно-цитоплазматического отношения, после чего начинается деление клеток путем митоза)

-анализ показателя возможен только в пределах одного вида клеток – т.е. невозможно сравнивать между собой лимфоциты и гепатоциты

Задачи исследования ядерно-цитоплазматического отношения:

1.оценка константы данной ткани - лимфоциты – высокое ядерно-цитоплазма

тическое отношение (приближается к единице – малые лимфоциты – 0,9; средние – 0,7)

- гепатоциты – низкое ядерно-цитоплазматическое отношение (0,45-0,55)

2.оценка функционального состояния клеток одной ткани

а. нормофункция - ядерно-цитоплазматическое отношение, характерное для данной ткани, константа – так в щитовидной железе тироциты стенки фолликулов – однослойный кубический эпителий

б. гиперфункция - сопровождается клеточной гипертрофией – увеличением клеточных разме-

ров за счет объема цитоплазмы, т.к. не происходит изменений количества ДНК в ядре, а значит и его размеров. Т.о. при гиперфункции ядерноцитоплазматическое отношение снижается,

5

6

становится более низким.

в. гипофункция - сопровождается клеточной гипотрофией - атрофией - уменьшением размеров клеток. При этом ядерно-цитоплаз- матическое отношение увеличивается.

Т.о. увеличение ядерно-цитоплазматического отношения в ткани свидетельствует о развитии гипофункции, а уменьшение - о гиперфункции ее клеток.

Проточная цитометрия

- метод количественного анализа клеток в потоке несущей жидкости с использованием проточных цитометров.

Основные принципы метода:

1. из ткани получают клеточную суспензию, состоящую из отдельных клеток

2.клетки обрабатывают веществами, количественно связывающимися с определенными клеточными структурами:

1.антитела – на белки в клеточной поверхности

2.ДНК-зонды

3.РНК-зонды и т.д.

3.использование флуоресцентной метки, присоединяемой к получаемому комплексу

4.выстраивание клеток в потоке жидкости в один ряд, в одну линию

5.возбуждение флуоресцентных меток на клетках энергией лазера

6.измерение интенсивности люминесценции метки ФЭУ

7.обработка полученных результатов на ЭВМ

8.результаты исследований представлены в виде гистограмм распределения и вариационных рядов цифровых значений

Варианты:

1.количественная гистохимия

-измерение количества веществ в клетке с помощью проведения химических реакций

-пример – ДНК-цитометрия

2.иммунофенотипирование

-выявление комплекса антиген-антитело

6

7

ДНК-цитометрия

- изучение количества ДНК в ядрах клеток

Задачи:

1.оценка уровня активности пролиферативных процессов в ткани

2.распределение ядер клеток по плоидности

3.определение временных параметров клеточного цикла

4.выявление состояний анэуплоидии – отличающегося от нормального содержание ДНК

Окраска:

Люминесцентный краситель в реакции по Фельгену

Результаты исследования:

В виде ДНК-гистограмм - распределение изучаемых клеток по содержанию в их ядрах ДНК.

Три группы клеток:

1.диплоидные - содержание ДНК - 2с (хромосом – 2n)

2.промежуточные - 2с-4с

3.тетраплоидные - 4с

Т.о., клетки с определенным содержанием ДНК распределяются по периодам клеточного цикла следующим образом:

2с - характеризуют количество клеток в Go и G1 периодах 2с-4с - количество клеток в синтетическом периоде

4с - количество клеток в G2 и М-периодах цикла

Расчет величины пролиферативного пула клеток:

Клетки:

1.синтетическом,

2.премитотическом

3.митотическом периодах цикла

-чем выше его величина – тем выше скорость обновления ткани наименьшая (стремиться к нулю) - в нейронах наибольшая - гемопоэтическая и эпителий слизистой

пищеварительной трубки (до 50%)

Временные параметры митотического цикла:

- время прохждения периодов цикла

7

8

Gо – период

А. всю клеточную жизнь - нейроны Б. несколько часов - стволовые клетки

Иммунофенотипирование

-метод качественного и количественного определения наличия исследуемых антигенов в клетках

рецепторных белков - антигенов

2.определение количества клеток, имеющих (экспрессирующих) этот рецептор в исследуемой популяции

3.определение количества рецепторов на поверхности клеток

4.определение сочетания нескольких рецепторов на поверхности одной клетки (коэкспрессия)

Окраска:

Моноклональные антитела, меченные люминесцентной меткой

Моноклональные антитела позволяют выявлять дифференцировочные антигены на гемопоэтических клетках крови у человека и имеют маркировку CD (cluster of differentiation) - кластер дифференцировки:

Практическое использование:

1.исследование клеточного иммунитета

2.оценка гемопоэза

Исследование клеточного звена иммунитета у человека:

8

9

2.оценка гемопоэза:

-1-4 классы зрелости – морфологически нераспознаваемые

-распознавание – иммунологическое – иммунофенотипирование

-суть метода

-часть рецепторных белков сохраняются в клетке всегда, они характеризуют тип кроветворения – лимфоидное, миелоидное и линию – Т- и В- лимфоциты

–при созревании клеток одни рецепторные белки на поверхности появляются, а другие исчезают

Иммуногистохимия

- метод качественного определения антигенов в клетках и тканях на гистологических срезах

Задачи метода:

1.определение гистогенетического типа исследуемой ткани

2.определение иммунофенотипа клеток

3.оценка процессов пролиферации (Ki-67, PCNA) и апоптоза (СD

95)в ткани

4.определение наличия рецепторов к гормонам

5.определение ростовых факторов (IL 1-16)

6.выявление онкопротеинов (р21, р53, N-MYC и т.д.)

7.определение типов коллагена (I, II, IY типа)

8.микробиология/вирусология (гепатиты В и С, цитомегаловирус, герпес и т.д.)

Окраска:

Моноклональные антитела

Определение гистогенетического типа клеток тканей:

-основано на выявлении белков промежуточных филаментов, специфичных для клеток определенных тканей

1. эпителиальные ткани - выявляется кератин (Кeratin)

2.соединительные ткани - виментин (Vimentin)

3.нервная ткань - S100 protein

4.мышечные ткани - десмин (Desmin)

9

10

Цитогенетический метод

- метод качественного и количественного анализа хромосом человека

Актуальность:

1.шесть из 1000 детей рождаются с различными хромосомными нарушениями

2.увеличение возраста матерей - критический возраст матери, после которого вероятность рождения больного ребенка резко возрастает – 35 лет

3.диагностика опухолевых заболеваний, учет при выборе тактики лечения и определение прогноза заболевания

Принцип метода:

-т.к. анализ осуществляется на хромосомах, а последние возможно наблюдать во время митоза то:

1.исследуемые клетки обрабатывают веществом, стимулирующим митотическую активность -

фитогемагглютинином (ФГА) в условиях in vitro

2накопление числа метафазных пластинок – в результате разрушения веретена деления - колхицин

3отбор метафазной пластинки, где хромосомы не наслаиваются, не наползают друг на друга

4.раскладка хромосом

5.анализ

10