Методы исследования в медицинской бактериологии

71

помощи пипетки или капельницы. По истечении времени окрашивания краску сливают, и препарат промывают легкой струей воды.

6. Высушивание препарата. После промывания препарата от избытка красителя остатки воды удаляют с предметного стекла. Для этого стекло берут за края с одного конца пинцетом и, ударяя ребром о мостик, добиваются удаления больших капель воды. Оставшуюся жидкость удаляют с верхней поверхности покровного стекла промоканием ее ребром фильтровальной бумаги, с нижней поверхности - протиранием фильтровальной бумагой. Досушивают препарат на воздухе. Окрашенный мазок должен быть совершенно сухим, так как остаток воды образует с иммерсионным маслом, нанесенным на мазок, мутную эмульсию, что мешает микроскопированию.

Порядок микроскопирования:

1.Установить зеркало микроскопа в соответствии с освещением (естественное или искусственное) и под малым увеличением (объектив х40, окуляр х7) отрегулировать совершенно светлое поле зрения.

2.Установить окрашенный препарат с каплей иммерсионного масла на предметный столик микроскопа и закрепить его держателями.

3.Заменить обычный объектив на иммерсионный (х90).

3.Под контролем глаза сбоку осторожно опустить макрометрическим винтом тубус до погружения иммерсионного объектива в масло.

4.Наблюдая в окуляр, при осторожных поворотах макрометрического винта определить контуры микробных клеток и с помощью микрометрического винта добиться их ясного изображения. Изучить препарат. В правильно окрашенном и хорошо промытом мазке поле зрения остается совершенно светлым и чистым, а окрашенными оказываются только микробные клетки.

5.Поднять тубус. Убрать препарат. Протереть объектив мягкой салфеткой, смоченной бензином, чтобы убрать остатки масла.

9. Поставить револьвер в нейтральное положение, подложить под него салфетку, опустить его до салфетки, закрыть микроскоп колпаком.

При микроскопировании окрашенных мазков полностью открывают диафрагму и поднимают конденсор до уровня предметного столика микроскопа.

Красители. При окрашивании мазка краситель проникает в микробную клетку. Это дает возможность рассматривать не только ее внешние признаки, но и некоторые особенности внутренней структуры клетки. В микробиологической практике для окрашивания клеток микробов применяют кислотные (кислые, протоплазматические), нейтральные и щелочные (основные, ядерные) органические красители. Кислотные красители реагируют со щелочными группами компонентов клеток, щелочные - с кислотными. Протеины окрашиваются и кислыми, и щелочными красителями.

Из основных красителей чаще применяют:

-красные красители: фуксин основной феноловый, сафранин, нейтральный красный, пиронин;

-фиолетовые красители: метиловый фиолетовый, генциановый фиолетовый (генциан виолет), кристаллический фиолетовый;

-синие красители: метиленовый синий, метиленовый голубой, азур II, виктория;

72

-зеленые красители: малахитовый зеленый, метиленовый зеленый;

-желто-коричневые красители: везувин, хризоидин.

Из кислых красителей используют:

-красные красители: фуксин кислый, эозин, эритрозин, конго красный;

-желтые красители: пикриновая кислота, конго;

-черные красители: нигрозин.

Растворы красителей могут быть как спиртовые, так и водные. Спиртовые растворы красителей более устойчивы. Их готовят заранее. Для этого порошок краски заливают этиловым спиртом (96%) в соотношении 1:10. Насыщенные растворы хранят в банках с притертыми пробками. Водные растворы красителей нестойки и окрашивают медленно. Для усиления действия красителя к нему добавляют протравляющее вещество, которое повышает стойкость водно-спиртовых растворов, способствует разрыхлению оболочки и лучшему прокрашиванию микробов. В качестве протравляющих веществ используют спирт, формалин, фенол, щелочи.

В лабораторной практике наиболее часто применяют следующие красители и растворы.

Красные красители представлены преимущественно фуксином (солянокислым, уксуснокислым или сернокислым розанилином, дериватом трифенилметана), который употребляется в микробиологической практике чаще всего. Он готовится в виде концентрированного карболового раствора - фуксина Циля, очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. В таком виде он употребляется только для бактерий, с трудом воспринимающих окраску (для окрашивания кислотоустойчивых и спорообразующих бактерий). Для окраски большинства бактерий фуксин Циля разводят в 10 раз дистиллированной водой, получая так называемый “разведенный фуксин” или “водный фуксин”. Разведенный фуксин очень нестоек и поэтому готовится непосредственно перед применением.

Порошок фуксина тщательно растирают с карболовой кислотой в ступке, добавив несколько капель глицерина; во время растирания приливают понемногу

73

спирт. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу (без комков), приливают понемногу, продолжая все время размешивать, дистиллированную воду. Дают постоять 2 суток, после чего фильтруют.

Фуксин основной, водно-спиртовый или водный (Пфейффера):

Разбавленный раствор фенола нестоек, поэтому его готовят перед применением.

Синие красители представлены метиленовым синим и метиленовым голубым.

Метиленовая синька, метиленовый синий или метиленовая синь (тиазин, тетраметилтионин) готовится заранее в виде насыщенного раствора.

Метиленовый синий, насыщенный раствор:

После смешивания компонентов смесь выдерживают в течение суток и фильтруют, после чего краситель готов к употреблению. Раствор стойкий и хорошо хранится в течение длительного времени.

Фиолетовые красители представлены генциановым фиолетовым, кристаллическим фиолетовым и эритрозином.

Генциановый фиолетовый феноловый раствор:

После полного растворения генцианового фиолетового растворы смешивают. Карболовый генцианвиолет готовят по следующему рецепту:

ступке, добавив несколько капель глицерина; во время растирания приливают понемногу спирт. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу (без комков), приливают понемногу, продолжая все время размешивать, дистиллированную воду. Дают постоять 2 суток, после чего фильтруют.

Кристаллический фиолетовый (по Хукеру):

Растворы смешивают и выдерживают перед использованием 2 суток.

Раствор эритрозина:

После растворения эритрозина и фенола смеси дают отстояться сутки.

Из числа черных красителей применяют жидкую тушь. Жидкую натуральную тушь разводят водопроводной водой в десять раз (1 мл туши в 9 мл воды), разливают в пробирки по 3-5 мл, автоклавируют при 0,5 ати. После этого суспензии дают отстояться 2 недели и используют для окраски некоторых компонентов клетки, в частности – капсул.

Сафранин. 2 г краски растворяют в 100 мл смеси спирта этилового 96%-ного и дистиллированной воды поровну или в 100 мл кипящей дистиллированной воды. Фильтруют.

Малахитовый зеленый (водный раствор). 1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Фильтруют.

Конго красный. 3 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор Люголя. 2 г калия йодида растворяют в 25 мл дистиллированной

воды. Затем к раствору добавляют 1 г йода кристаллического, доводят до 300 мл

Смесь кипятят, после охлаждения – фильтруют.

Для выявления и дифференциации различных структур клеток микробов разработано большое количество способов окрашивания фиксированных препаратов микробов. В зависимости от числа применяемых красителей принято подразделять способы окрашивания на простые и сложные (дифференциальные). В простых способах применяют один краситель, в сложных – несколько красителей. Простая окраска позволяет изучать общую морфологию микробов. При этом вся клетка окрашивается в один цвет, но разные структуры клетки окрашиваются с разной

75

интенсивностью. При сложных (дифференциальных) способах окраски разные структуры клетки окрашиваются в разные цвета.

Простой метод окрашивания. При простой окраске обычно употребляется только одна краска, чаще всего красная (фуксин Пфейффера) или синяя (метиленовая синька по Лёффлеру). Фуксин красит быстрее (1-2 минуты) и интенсивнее и окрашивает одинаково все виды бактерий. Синька красит медленнее (3-5 минут), менее ярко, но она дает окраску различной интенсивности у разных видов бактерий.

Техника простого окрашивания. Фиксированный препарат помещают на мостик, находящийся над кристаллизатором. На препарат из капельницы наносят 1- 2 капли раствора красителя. Окрашивание препарата можно также производить в емкости с раствором красителя или с помощью полоски фильтровальной бумаги. В этом случае полоску бумаги помещают на препарат и смачивают 2 каплями раствора красителя, добиваясь плотного прилегания полоски к поверхности стекла. Для окрашивания используют также полоски фильтровальной бумаги, предварительно пропитанные красителем и высушенные. Такую полоску бумаги накладывают на препарат, наносят на нее несколько капель дистиллированной воды и выдерживают необходимое для окрашивания время.

При всех способах окраски краситель на препарате выдерживают в течение 1-2 минуты. По истечении этого времени избыток красителя сливают (убирают полоску бумаги), остатки красителя смывают дистиллированной водой и препарат высушивают.

Сложные методы окрашивания основаны на особенностях физикохимического строения отдельных структур микробной клетки. Эти методы применяются для детального изучения структуры клетки, а также для характеристики и дифференциации одних микробов от других. Для сложного окрашивания используют несколько красителей. В лабораторной практике из сложных методов окрашивания применяют метод Грама, Циля-Нельсена, и некоторые другие. Чаще всего в микробиологических лабораториях используют окраску по Граму.

Окраска бактерий по Граму. Метод окраски по Граму является самым универсальным из сложных способов окраски. Все бактерии по своему отношению к этому методу разделяются на две группы: красящиеся по Граму - грамположительные (грампозитивные), и не красящиеся по Граму - грамотрицательные (грамнегативные). Отношение к окраске по Граму является важным дифференцирующим признаком бактерий и обязательно используется при их характеристике. Окраска по Граму позволяет предварительно оценить морфотип бактерий (в первую очередь - отношение бактерий к группе грамотрицательных или грамположительных микроорганизмов) и их морфологию (кокки, палочки и др.).

Окрашивание микробов по Граму зависит от химического состава клеточной стенки бактерий (рисунок 60).

77

водой, препарат высушивают при комнатной температуре или фильтровальной бумагой (рисунок 61).

Рисунок 61 – Грамположительные кокки (синие) и грамотрицательные палочки

(розовые) при окраске по Граму. Заимствовано из Интернет-ресурсов. Прибор для автоматической

Для окраски бактерийокраскипо ГрамуповыпускГрамуются специальные приборы PREVI®Color, позволяющие автоматизировать процесс окрашивания (рисунок 62).

Рисунок 62 – Прибор для окраски бактерий по Граму. Заимствовано из Интернетресурсов.

Прибор PREVI®Color позволяет окрашивать до 30 слайдов за 5 минут, причем все слайды окрашиваются стандартно.

Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим микроскопирования. Тест Грегерсена заключается в следующем: в капле 3% водного раствора едкого калия на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной питательной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду бактерий. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются - реакция отрицательная.

Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые с трудом воспринимают красящие вещества в результате наличия в клеточной стенке специфических компонентов (липиды, воска). Предложено

78

несколько способов воздействия на клеточную стенку кислотоустойчивых бактерий (карболовой кислотой, высокой температурой). Основным способом окраски кислотоустойчивых бактерий является способ Циля-Нельсена. Именно этим способом пользуются для обнаружения кислотоустойчивых туберкулезных палочек в мокроте больных туберкулезом.

Для окраски по Цилю-Нельсену на фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги и наносят несколько капель карболового фуксина Циля. Можно использовать заранее заготовленную пропитанную фуксином и высушенную фильтровальную бумагу, на которую наносят 2-3 капли воды. Мазок с краской 2-3 раза подогревают на пламени спиртовки до появления паров, каждый раз отставляя препарат в сторону для охлаждения. Бумажку с краской снимают, и остывший препарат промывают водой. Препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты и тщательно промывают водой. Докрашивают препарат раствором

Рисунок 63 – Окрашивание микобактерий туберкулеза (рубиново-красные палочки) методом Циля-Нельсена. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для окрашивания некоторых бактерий (в частности, спирохет) используют метод Романовского-Гимзы. Краска Романовского-Гимзы – это смесь азура, эозина и метиленовой синьки. Раствор этой краски сине-фиолетового цвета. Она окрашивает цитоплазму клеток в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий - в красно-фиолетовый цвет. Окрашивание по РомановскомуГимзе позволяет обнаружить различные структурные компоненты клеток. Непосредственно перед окрашиванием бактерий к 10 мл дистиллированной воды добавляют 10 капель краски Романовского-Гимзы и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют (рисунок 64).

79

Рисунок 64 – Микроскопическая картина боррелий, окраска по РомановскомуГимзе. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для выявления некоторых структурных компонентов бактериальной клетки разработаны специальные методы окраски.

Для выявления капсулы у бактерий применяют метод окрашивания Бурри или Бурри-Гинса. Для окраски по методу Бурри на предметное стекло наносят каплю туши, а рядом с ней - каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью стекла со шлифованным ребром из полученной смеси готовят толстый мазок. После высыхания на мазок наносят иммерсионное масло и микроскопируют с иммерсионной системой. На черном фоне микробные клетки выглядят в виде темных тел, окруженных светлой зоной (рисунок 65).

Рисунок 65 – Окраска капсулы по методу Бурри. Заимствовано из Интернетресурсов.

При окраске капсулы по методу Бурри-Гинса мазок высушивают, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают тушью и фуксином или сафранином в течение 2-3 минут. Краситель сливают, мазок высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и четко выделяются на черном фоне (рисунок 66).

80

Рисунок 66 – Окрашивание капсулы методом Бурри-Гинса. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для выявления капсулы бактерий используют также метод Ольта. При этом мазок окрашивают 2-3% раствором сафранина. Краситель готовят перед употреблением, растворяя его в горячей воде с последующим фильтрованием. Окрашивают при легком нагревании в течение 1-3 минут и быстро промывают водой. Препарат не высушивают, на нем должна быть вода, накрывают покровным стеклом и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа. Световые лучи, проходя через слой воды, усиливают разницу в преломлении лучей от капсулы и тела микробной клетки. В поле зрения микроскопа видно, что тела микробных клеток окрашены в красный цвет, капсулы - в желтый (рисунок 67).

Капсула

Бактерия

Рисунок 67 – Окрашивание капсулы по методу Ольта. Заимствовано из Интернетресурсов.

Метод Михина также используется для выявления капсулы бактерий. Фиксированный мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 2-3 минут при подогревании. Краситель быстро смывают водой, мазок высушивают. При микроскопировании микробные клетки выглядят темно-синими, капсулы - светло-розовыми (рисунок 68).