Методы исследования в медицинской бактериологии

131

Рисунок 131 - Пластина ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-12 для дифференциации энтеробактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Рисунок 132 - Пластина ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-24 для дифференциации энтеробактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Тест-системы ЭНТЕРОтест 24 (PLIVA-Lachema, Чехия) предназначены также для идентификации энтеробактерий по 24 признакам в течение 18-24 часов (рисунок 133). Учет результатов этих тестов производится как визуально по изменению окраски, так и с помощью анализаторов (Multiscan, iEMS-reader, Финляндия).

133

Кроме стрипов для биохимической идентификации бактерий выпускаются

Рисунок 135 – Биохимическая панель RapID STAPH PLUS Panel для идентификации стафилококков. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для идентификации энтеробактерий разработана специфическая система Enterotube (США), представляющая собой пробирку с 12 отсеками, заполненными различными агаровыми средами. Некоторые среды покрыты слоем воска для защиты от воздуха. Через отсеки проходит канал с тонким металлическим стержнем (рисунок 136).

Рисунок 136 - Система Enterotube. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Выступающим концом стержня под белой крышкой касаются колонии и затем протягивают стержень через все отсеки. Таким способом засевают все среды в отсеках. Порядок проведения посева подробно описан в прилагаемой инструкции. Инкубируют системы в течение 24 часов при температуре 36ОС. Дальнейшая идентификация происходит с использованием кодовой книги.

Стрипы биохимической идентификации используются для идентификации бактерий до вида за 24 часа. Метод биохимической идентификации бактерий с помощью стрипов признан референсным методом во многих странах, в том числе в России.

Методика работы с микротест-системами состоит в следующем. Вначале выделяют чистую культуру бактерий и путем микроскопического исследования окрашенных по Граму мазков устанавливают принадлежность бактерий к

134

грамположительным или грамотрицательным палочкам или коккам для выбора необходимой тест-системы. При необходимости с помощью экспресс-тестов определяют каталазу и оксидазу. Затем готовят бактериальную суспензию с определенной концентрацией клеток по стандарту мутности. Полученную бактериальную суспензию аккуратно вносят в каждую лунку или ячейку, содержащую дифференциально-диагностические среды и индикаторы (субстратноиндикаторные питательные среды). Содержимое ячеек некоторых тест-систем стабилизировано поливиниловым спиртом. В некоторые лунки для создания анаэробных условий добавляют стерильное вазелиновое масло или расплавленный парафин в соответствии с инструкцией. Инкубируют тест-системы в термостате при рекомендованной инструкцией температуре в течение необходимого времени в зависимости от вида бактерий. При необходимости для выявления тех или иных соединений в некоторые ячейки добавляют дополнительные ингредиенты, прилагаемые к тест-системам. Учет результатов проводится визуально или с помощью микробиологических анализаторов. Идентификация осуществляется при помощи таблиц биохимической активности, профильных индексов, диагностических регистров или компьютерных программ в зависимости от вида используемых тест-систем.

5.2.6. Полуавтоматические и автоматические системы идентификации микроорганизмов и определения антибиотикочувствительности

Повышение точности идентификации бактерий возможно с использованием бактериологических полуавтоматических и автоматических анализаторов и систем для экспресс-диагностики. Недостатком полуавтоматических и автоматических анализаторов является обязательное наличие чистой культуры возбудителя. Тем не менее, автоматические анализаторы идентификации бактерий позволяют за 24-48 часов получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к антимикробным препаратам.

Полуавтоматические и автоматические системы выпускаются многими производственными компаниями (“bioMerieux”, Франция; “Beckman” США; “LACHEMA”, Чехия; “Labsystems”, Финляндия).

Системы Microscan (“Beckman” США) используют турбидиметрические, колориметрические и флюориметрические методы идентификации бактерий. Они состоят из комплектов пластиковых планшетов, содержащих различные субстраты (96 лунок). Эти системы позволяют дифференцировать грамположительные и грамотрицательные бактерии с помощью флюоресцирующих субстратов за 2 часа. Система позволяет идентифицировать грамположительные и грамотрицательные бактерии, сложные для культивирования микробы (анаэробы, нейссерии, гемофилы, моракселы, грибы). Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей используют хромогенные субстраты, изменяющие свою окраску (время анализа – 4- 6 часов). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков эти системы определяют по изменению оптической плотности. Системы Microscan

136

Система Vitek 2 (“bioMerieux”, Франция) представляет собой автоматическую усовершенствованную систему для идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к антимикробным препаратам. Она предназначена для идентификации более 450 таксонов (грамотрицательных палочек, грамположительных кокков, анаэробных бактерий, нейссерий, гемофильных палочек, других прихотливых бактерий, коринебактерий, лактобактерий, бацилл, грибов). Она позволяет также определять чувствительность к антимикробным препаратам и минимальную ингибирующую концентрацию антибиотиков. Среднее время получения результата идентификации чистой культуры составляет 5-6 часов. Среднее время получения результата чувствительности к антимикробным препаратам - 7-8 часов. Внешний вид системы Vitek-2представлен на рисунке 139.

Автоматические бактериологические

Рисунок 139анализаторы- Система Vitek 2. ЗаимствованоVitekиз Интернет2 -ресурсов.

В зависимости от комплектации приборов и количества одновременно выполняемых анализов выпускается несколько модификаций анализаторов Vitek 2 (рисунок 140).

Рисунок 140 – Модификации автоматических бактериологических анализаторов Vitek 2. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Анализатор mini API (“bioMerieux”, Франция) представляет собой полуавтоматизированный настольный анализатор для быстрой идентификации и определения антибиотикочувствительности бактерий. Позволяет по 25 стрипам

137

определять энтеробактерии, стрептококки, стафилококки, анаэробные бактерии, дрожжи. Время исследования – от 4 до 24 часов (рисунок 141).

Рисунок 141 - Анализатор mini API. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Система МикроТакс (SY-LAB Geraete GmbH, Австрия) представляет собой автоматизированную систему для идентификации микроорганизмов и определения их чувствительности к антибиотикам. Система предназначена для тестирования микроорганизмов на планшетах. Принцип ее действия состоит в фотометрической регистрации результатов биохимических реакций и компьютерной обработке данных. В состав системы входят МикроТакс Ридер МТ-1, МикроТакс Инкубатор МТ-5, МикроТакс Диспенсер Мт-10 и МикроТакс компьютер с программным обеспечением для автоматической регистрации и обработки данных (рисунок 142).

Рисунок 142 - Система МикроТакс. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Экспрессность системы МикроТакс заключается в том, что бактериальная суспензия вносится вручную (при малом количестве исследуемых проб) или автоматически с помощью программируемого диспенсера (при большом количестве проб). После инкубации планшеты прочитываются в ридере, и с помощью компьютерных программ производится обработка данных. Результаты идентификации бактерий выдаются через 4,5-6 часов, а данные по чувствительности

138

микроорганизмов к антибиотикам – через 6-24 часа. Для идентификации в системе МикроТакс достаточно одной колонии суточной культуры бактерий, выросших на агаризованной среде.

Анализатор микробиологический Phoenix 100 (Becton Dickinson, США)

для видовой идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к антибиотикам позволяет идентифицировать 160 видов грамотрицательных микроорганизмов, 145 видов грамположительных микроорганизмов, 64 вида грибов и дрожжей. Скорость идентификации составляет от 2 до 5 часов. В анализаторе одновременно используются хромогенные, флуорогенные, индикаторные биохимические субстраты, а система измерений основана на колориметрическом, турбидиметрическом и флуорометрическом методах исследования (рисунок 143).

Рисунок 143 - Анализатор микробиологический Феникс 100. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Среди других анализаторов используются микробиологический экспрессанализатор БиоТрак 4250 (исследование, контроль качества и сертификация продуктов питания, сырья, напитков, воды, косметических средств, контроль стерильности материалов и растворов), бактериологический анализатор гемокультур BACTEC 9050 (диагностика сепсиса в максимально короткие сроки), баканализатор Адажио (система считывания антибиотикограмм и расчета минимальных ингибирующих концентраций антибиотиков), автоматизированные системы гемокультивирования (например, BD BACTECTM).

Ведущая международная компания по разработке и производству медицинского оборудования BD (Becton Dickinson) предлагает уже полностью автоматизированную бактериологическую рабочую станцию (BD Kiestra WCA) и автоматизированную микробиологическую лабораторию (BD Kiestra TLA), позволяющие не только автоматизировать процесс, но и автоматически визуализировать результаты исследования в динамике.

Уникальную станцию полностью автоматизированного микробиологического посева WASP предлагает фирма Copan (Италия). Эта роботизированная система объединяет в себе процесс микробиологического посева, приготовления мазка и пересев в бульон (рисунок 144).

139

Рисунок 144 – Станция WASP фирмы Copan (Италия). Заимствовано из Интернетресурсов.

Разработка новых автоматизированных комплексов для микробиологических исследований продолжается.

140

6. Фагоидентификация и фаготипирование

Высокая чувствительность бактерий к специфическому бактериофагу позволяет отличить одни виды бактерий (даже близкородственные виды) от других видов (возбудителя чумы от возбудителя псевдотуберкулеза, холерный вибрион от холероподобного). С помощью бактериофагов можно определить типы (варианты) внутри одного вида бактерий (например, измененные штаммы бруцелл). Поэтому бактериофаги используются для фагодиагностики инфекций (фагоидентификации и фаготипирования бактерий).

При проведении фагодиагностики культивирование бактерий осуществляют на плотной или в жидкой питательной среде. Размножение фагов в бактериальных культурах на плотных питательных средах сопровождается лизисом бактерий и образованием зон просветления (стерильных пятен, бляшек или негативных колоний). Разные фаги формируют негативные колонии определенных размеров и формы. Размножение бактериофагов в жидких культурах сопровождается просветлением среды, бывшей перед заражением фагом мутной.

Фагоидентификация бактерий – это установление вида бактерий с помощью бактериофагов. Фаготипирование – это установление типа (варианта) бактерий с помощью бактериофага. Фагодиагностика проводится методами Отто, Фишера и Фюрта.

Метод Отто (метод стекающей капли) используется для идентификации неизвестных бактерий с помощью известных диагностических фагов. Для выполнения этого метода на чашку с МПА наносится капля суточной бульонной культуры и шпателем круговыми движениями распределяется по поверхности агара. Затем на поверхность культуры наносится капля суспензии известного бактериофага и наклоном чашки дают капле стечь по поверхности агара. Посевы инкубируют в термостате в течение суток, после чего учитывают результаты. При соответствии фага и бактерий в месте нанесения диагностического фага рост культуры отсутствует (рисунок 145).

Рисунок 145 - Фагоидентификация бактерий по методу Отто. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Метод Фишера также используется для идентификации неизвестных бактерий с помощью известных фагов. Для выполнения этого метода каплю