Методы исследования в медицинской бактериологии

91

пептонный бульон, мясопептонный агар. В состав сложных сред дополнительно к простым средам входят соли, сахара, экстракты, микроэлементы, витамины и другие компоненты. К сложным (богатым) питательным средам относятся кровяной агар, асцитический агар, сывороточный агар.

По консистенции выделяют жидкие, полужидкие и плотные среды. Жидкие среды представляют собой настои, отвары, бульоны, приготовленные на основе мяса, рыбы, овощей (естественные среды), а также композиции определенных концентраций химических соединений (искусственные среды). Широко распространенной жидкой питательной средой является мясопептонный бульон (МПБ). Полужидкие среды получают путем добавления к жидким средам 0,5-0,9% агара или желатина (в частности, мясопептонный желатин - МПЖ). К плотным питательным средам относят среды, содержащие 1,5-3% агара, в частности, мясопептонный агар - МПА (рисунок 80).

Агар – это полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных питательных сред.

В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны (продукты расщепления белков пепсином) или различные гидролизаты (мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой).

По назначению среды подразделяются на основные (универсальные) и специальные. Основные (универсальные) среды пригодны для роста большинства бактерий. К ним относятся мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон

(МПБ).

Специальные среды предназначены для культивирования тех бактерий, которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. В частности, среда Китта-Тароцци (мясопептонный печеночный бульон, МППБ) используется для культивирования анаэробов. В ее состав входят: питательный бульон, 0,5% натрия хлорида, кусочки печени или мяса для адсорбции кислорода. На поверхность среды наслаивают тонкий слой вазелинового масла и стерилизуют при 120°С в течение 30 минут. Перед посевом из среды удаляют воздух прогреванием ее на кипящей водяной бане в течение 15 минут.

Для выделения облигатных анаэробных бактерий используют также следующие питательные среды:

- анаэробный кровяной агар с гентамицином;

93

разливают в пробирки с “газовками” (поплавками, трубками Дюлхема), опущенными в пробирки вверх дном. Среды Гисса могут быть жидкие и полужидкие (без “газовок”), содержащие 0,25% агара. В жидких средах с реактивом Андреде при ферментации углевода образуется кислота, под действием которой изменяется окраска среды (среда меняет желтый цвет на красный). Образовавшиеся при ферментации углевода газообразные продукты скапливаются в поплавках (рисунок 81).

1 2 3

Рисунок 81 – Среды Гисса с реактивом Андреде: 1 – исходная среда; 2 – ферментация углевода до кислоты; 3 – ферментация углевода до кислоты и газа. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Полужидкие среды Гисса с реактивом ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты) при разложении углевода до кислоты меняют окраску с желтой на синюю, а газообразование проявляется пузырьками в толще среды (рисунок 82).

1 2 3

Рисунок 82 – Среды Гисса с реактивом ВР: 1 – исходная среда; 2 – разложение углевода до кислоты; 3 – разложение углевода до кислоты и газа. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Вариантом сред Гисса в пробирках являются картриджи с питательной средой и индикатором. Внесение исследуемого материала в них осуществляется через центральный капилляр (рисунок 83).

94

Контроль

Рисунок 83 – Картриджи “пестрого ряда”: 1 – глюкоза; 2 – лизин; 3 – орнитин; 4 – индол; 5 – адонит; 6 – лактоза; 7 – арабиноза; 8 – сорбит; 9 – тест ФогесаПроскауэра (образование ацетоина при анаэробном превращении глюкозы); 10 – дульцит; 11 – мочевина; 12 – цитрат натрия.

Среда Левина состоит из МПА, лактозы и индикатора (метиленовый синий, эозин и фосфорнокислый калий). Среда имеет первоначально фиолетовый цвет. На среде Левина лактозоположительные колонии E. coli имеют темно-фиолетовый (черный) цвет с зеленым блеском (рисунок 84).

Рисунок 84 - Лактозоположительные колонии E. coli на среде Левина. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Среда Эндо состоит из МПА, 0,5-1% лактозы и 0,5% насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного 10% сернокислым натрием. Среда Эндо предназначена для выделения энтеробактерий и родственных микроорганизмов с одновременной их дифференцировкой по способности утилизировать лактозу. На такой среде лактозопозитивные бактерии (E. coli) образуют темно-красные колонии с металлическим блеском, а лактозонегативные бактерии (шигеллы, сальмонеллы) – колонии серо-белого цвета (рисунок 85).

95

Рисунок 85 – Рост лактозоположительной кишечной палочки на среде Эндо. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Среда Плоскирева предназначена для выделения патогенных энтеробактерий (шигеллы, сальмонеллы) с одновременным подавлением роста кишечной палочки. Элективным фактором этой среды являются соли желчных кислот. Так как рост кишечной палочки подавляется не полностью, для ее выявления в среду добавлена лактоза (дифференцирующее вещество). Лактозонегативные бактерии (шигеллы, сальмонеллы) образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные бактерии (кишечная палочка) – темно-красные колонии (рисунок 86).

Рисунок 86 – Рост лактозоположительной кишечной палочки и лактозонегативных бактерий на среде Плоскирева. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

К дифференциально-диагностическим средам относят также комбинированные полиуглеводные среды (двухсахарная среда Рассела, трехсахарная среда Клиглера, трехсахарный железосодержащий агар Олькеницкого и др.). Например, среда Олькеницкого содержит: 100 мл МПА, 1 г лактозы, 1 г сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,02 г соли Мора, 0,003 г тиосульфата натрия, 0,4 мл фенолового красного (0,4%-го раствора); рН7,2-7,4 (рисунок 87).

96

1 2 3 4 5

Рисунок 87 – Среда Олькеницкого (1) и рост на ней бактерий: Salmonella typhimurium (2), Escherichia coli (3), Shigella flexneri (4) и Salmonella typhi (5).

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) является дифференциально-

диагностической средой при выделении сальмонелл. Среда состоит из МПА и индикатора, содержащего лимоннокислый висмут, сернокислый натрий, соль Мора (серноаммонийная соль железа), двухосновной фосфорнокислый натрий, глюкозу и бриллиантовую зелень. Сальмонеллы образуют на этой среде колонии черного цвета (рисунок 88).

Рисунок 88 – Рост сальмонелл на висмут-сульфитном агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Протеолитическую активность бактерий (рисунок 89) определяют по разжижению столбика желатина (наличие желатиназы) или по образованию зон просветления вокруг колоний на молочном агаре (наличие казеиназы).

агаре)

1 2

Рисунок 89 – Протеолитическая активность бактерий в столбике желатина (1) и на молочном агаре (2). Заимствовано из Интернет-ресурсов. 21

Гемолитическая активность бактерий определяется на кровяном агаре (рисунок 90).

Рисунок 90 – Рост бактерий на кровяном агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Селективные питательные среды содержат вещества, препятствующие росту одних видов бактерий, и вещества, способствующие росту других видов микроорганизмов. Селективные питательные среды позволяют направленно отбирать определенные виды бактерий. К ним относятся желточно-солевой агар для выделения стафилококков, щелочной агар для выращивания холерного вибриона и др. Например, солевой агар, предназначенный для выделения стафилококков, в качестве элективного фактора содержит повышенную концентрацию (10%) хлорида натрия. Желточно-солевой агар содержит не только элективный фактор (хлорид натрия), но и дифференцирующее вещество (желток куриного яйца), позволяющее определять у стафилококков наличие лецитиназы (рисунок 91).

98

Рисунок 91 - Желточно-солевой агар для выделения стафилококков. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Элективные питательные среды содержат вещества, подавляющие рост одних бактерий, но не влияющие на рост других бактерий. Эти среды служат для выделения определенных видов бактерий из смешанных популяций. К элективным средам относятся, например, селенитовая среда, среда Мюллера.

Накопительные среды (обогатительные среды, среды обогащения) - это жидкие среды, на которых определенные виды культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих микроорганизмов. Такие среды могут содержать вещества, подавляющие рост посторонних микробов, или вещества, способствующие росту требуемых бактерий. К накопительным средам относятся, например, солевой бульон для стафилококков, селенитовый бульон для сальмонелл (рисунок 92).

а б Рисунок 92 – Накопительные среды: а - солевой бульон, б - селенитовый бульон.

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Так, солевой бульон (обогатительная среда для стафилококков) в качестве элективного фактора содержит 10% хлорида натрия, селенитовый бульон (обогатительная среда для сальмонелл) в качестве элективного фактора содержит селенит натрия, а сахарный бульон (обогатительная среда для стрептококков) содержит глюкозу в качестве ростового фактора.

Для длительного хранения микроорганизмов в условиях холодильника применяют консервирующие среды, содержащие криопротекторы (например, глицерин).

99

Транспортные среды используются на этапах доставки биоматериала в лабораторию. Состав таких сред способствует сохранению микробов в жизнеспособном состоянии без размножения. В связи с этим в биоматериале количественный и качественный состав микробиоты не изменяется.

Введение в питательные среды дифференцирующих субстратов (углеводов, белков, мочевины и др.) и соответствующих индикаторов позволяет по окраске колоний и среды вокруг них отличать одни бактерии от других. Дифференциация бактерий при таком подходе осложняется тем, что сахаролитические и протеолитические ферменты микроорганизмов многообразны и универсальны (встречаются у представителей разных видов). Это обусловливает относительно невысокие дифференцирующие свойства традиционных питательных сред. Для более четкой дифференциации бактерий целесообразно определять родо- и видоспецифические ферменты.

Таким образом, в состав питательных сред могут входить различные компоненты, позволяющие не только создавать благоприятные условия для размножения бактерий, но и стимулировать рост одних микробов и угнетать рост других микроорганизмов. Назначение наиболее распространенных компонентов питательных сред представлено в таблице 12.

Таблица 12 – Компоненты питательных сред и их назначение

100

В таблице 13 приведены примеры наиболее часто используемых в бактериологии питательных сред.

Таблица 13 – Часто используемые в бактериологии питательные среды

Во второй половине ХХ века в бактериологическую практику были введены хромогенные питательные среды, принцип действия которых состоял в выявлении высокоспецифичных бактериальных ферментов. Хромогенные питательные среды позволяют уже на первом этапе через 24 часа культивирования получить результат о видовой принадлежности микроба. К таким высокоспецифическим ферментам относятся β-D-глюкуронидаза Escherichia coli или β-D-глюкозидаза энтерококков. На хромогенных питательных средах по цвету колоний можно проводить предварительную идентификацию бактерий.

Для обнаружения такого уникального фермента в состав хромогенной питательной среды вводят вещество (хромогенный субстрат), при расщеплении которого этим ферментом образуются окрашенные или флюоресцирующие продукты, выявляемые по изменению окраски колоний или их флюоресценции при