Методы исследования в медицинской бактериологии

222

F2c, соответственно, BIP – обратный внутренний праймер состоит из двух частей: B1c (5’) и B2 (3’), комплементарных участкам B1 и B2c, соответственно.

Для эффективной LAMP достаточно менее 10 копий целевого участка нуклеиновой кислоты в исходной реакционной смеси.

Процесс амплификации нуклеиновой кислоты при этом методе включает 3 основных этапа:

-образование базовой гантелеобразной (петлеобразной) структуры;

-циклическая амплификация;

-элонгация и повторение циклов.

Процесс амплификации в LAMP-методе представлен на рисунке 224.

Рисунок 224 – Процесс петлевой изотермической амплификации нуклеиновых кислот. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Внешние праймеры (F3 и B3) необходимы лишь в самом начале реакции для разделения двух материнских цепей. Образование гентелевидной структуры происходит с помощью специально подобранных внутренних праймеров. Именно они формируют петли на концах искомого фрагмент. Для этого к 5′-концу праймера F2 прикреплена вторая часть (F1c), комплементарная F1 части матрицы. Полученный фрагмент F1c-F2 представляет собой прямой внутренний праймер (FIP) длинной до 50 нуклеотидов (обозначение F происходит от англ. forward – “прямой”).

223

F2 регион внутреннего праймера FIP гибридизируется с мишенью, а цепь достраивается с помощью ДНК-полимеразы. Затем внешний праймер F3присоединяется к F3c фрагменту мишени, и ДНК-полимераза достраивает цепь, смещая синтезированную последовательность, которая формирует петлеобразную структуру на 5′-конце, так как F1с-участок гибридизируется с F1-регионом.

То же самое происходит и с праймерами, садящимися на противоположный 3′-конец матрицы (обозначение B происходит от англ. backward – “обратный”). В конечном итоге, формируется одноцепочечный фрагмент ДНК с петлями с обеих сторон – своеобразная гантелевидная структура (dumbbell structure). С образованием такой структуры завершается первый этап LAMP.

После образования петлеобразной структуры с 3′-конца Bst-полимераза продолжает синтез к 5′-концу, в результате чего образуется “рукоятка” (stemloop). Концы “рукоятки” также замыкаются в петли, в результате чего формируются загзагообразные продукты.

Использование в дальнейших разработках петлевых праймеров позволило проводить синтез с петель в обе стороны. В результате этого уже через 10-20 минут возможно регистрировать продукт в достаточном количестве.

В качестве матрицы при проведении LAMP можно использовать как ДНК, так и РНК. В случае использования в качестве матрицы РНК в реакционную смесь добавляют обратную транскриптазу. Такой вариант метода называется RT-LAMP (reverse transcription-coupled LAMP).

Этапы проведения LAMP:

-начало амплификации – посадка олигонуклеотидов FIP и BIP и наработка гантелевидных ДНК-структур с двумя петлями;

-циклическая амплификация – наработка ДНК-продуктов с гантелевидной структурой;

-элонгация – наработка ДНК-продуктов различной длины и с множеством

петель.

Детекцию продуктов LAMP можно проводить методом агарозного гельэлектрофореза, однако этот способ трудоемкий и длительный. Проще добавить к реакционной смеси интеркалирующий краситель (например, бромистый этидий, пропидиум йодид и др.) и наблюдать за изменением флюоресценции в ходе процесса с помощью специального реал-тайм флуориметра для LAMP. Вместо красителей можно использовать специальные флюоресцентные зонды.

Выделяют следующие методы детекции, используемые в LAMP-методе:

-визуализация продуктов реакции электрофорезом с окрашиванием бромидом этидия;

-флюоресцентная детекция в растворе с интеркалирующими агентами;

-турбидиметрическая визуализация (образование нерастворимого пирофосфата);

-турбидиметрия с флюоресценцией;

-BART - турбидиметрия с люминесценцией;

-электрохимическое определение продуктов;

-использование флюоресцентно-меченых праймеров.

Некоторые способы детекции представлены на рисунке 225.

224

Рисунок 225 - Способы детекции продуктов реакции LAMP / RT-LAMP: слева – агарозный гель-электрофорез с окраской бромистым этидием; справа – окраска реакционной смеси интеркалирующим красителем.

В таблице 24 представлена сравнительная характеристика методов ПЦР и

LAMP.

Таблица 24 - Сравнительная характеристика ПЦР и LAMP

225

12. Методы масс-спектрометрии

Масс-спектрометрия позволяет проводить идентификацию более 4000 видов микроорганизмов, сокращая при этом сроки идентификации на 24-72 часа. Один из важных показателей – экономичность методики, которая почти не требует затрат на реактивы и расходные материалы. В клинической микробиологии массспектрометрия позволяет с высокой точностью определить количественный и качественный состав вещества, его структуру, физико-химические свойства.

Масс-спектрометрия представляет собой физический метод измерения отношения массы заряженных частиц вещества к их заряду (m/z). Приборы, которые реализуют этот метод, называются масс-спектрометрами. Они состоят из источника ионов, системы разделения ионов (анализатор) и детектора. Чтобы получить массспектр надо превратить молекулы и атомы органического вещества в заряженные частицы – ионы (осуществляется в источнике ионов), разделить полученные ионы в пространстве и времени (осуществляется в анализаторе) и зафиксировать сигнал от полученных заряженных частиц (осуществляется в детекторе).

Масс-спектрометры используются в следующих направлениях микробиологии:

-идентификация микроорганизмов в биологических средах;

-видовое и родовое типирование бактерий;

-определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Способы масс-спектрометрии (MS):

1 способ – по спектру белков микробов – белковое профилирование

(MALDI-TOF MS);

2 способ – по клеточным липидам – метод газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) и метод жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ/МС).

Масс-спектрометрия наиболее полно реализована в технологии MALDI-TOF. MALDI (МАЛДИ, матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация)

представляет собой “мягкий” способ ионизации твердого вещества, обусловленный воздействием лазерного излучения на смесь матрицы с анализируемым веществом. Иными словами, МАЛДИ - это система получения ионов из твердой фазы. Вспомогательная матрица снижает разрушительные свойства лазерного излучения, что обеспечивает ионизацию крупных биомолекул без деградации.

TOF (Time of Flight) – это принцип работы анализатора масс-спектрометра, заключающийся в разделении ионов в вакууме и фиксации времени пролета ионов в зависимости от их массы (измерение скорости дрейфа частиц в специальной трубе). Метод фиксирует время пролета заряженными частицами конкретного расстояния и разделяет ионы по этому признаку. Время пролета пропорционально отношению массы частицы к ее заряду. Фиксируемые время-пролетные характеристики неизвестных микроорганизмов сравниваются с имеющейся базой данных.

Преимущества метода масс-спектрометрии:

-быстрота проведения исследования;

-точность и достоверность результатов;

-подключение масс-спектрометра к автоматическим системам идентификации микроорганизмов;

226

-экстракция белков может быть проведена непосредственно на слайде;

-уверенность: одноразовые слайды исключают риск контаминации и не требуют мытья;

-высокое разрешение: высокая воспроизводимость идентификации спектров белков микроорганизмов в диапазоне более 10 кДа. Возможность сканирования веществ массой до 500 кДа;

-база данных состоит из клинически значимых видов и более 25000 спектров. Надежная валидация с использованием Расширенного Классификатора Спектров для достоверной идентификации. Для каждого вида в базе данных получены спектры большого количества штаммов.

Метод позволяет проводить и субтипирование микроорганизмов. Этапы масс-спектрометрического анализа:

-пробоподготовка (первичный посев клинического материала на питательную среду);

-мягкая ионизация - MALDI;

-сортировка ионов по массам и по времени пролета (TOF);

-идентификация (Biotyper).

Возможности и преимущества метода MALDI:

-замена всех морфологических и биохимических методов идентификации;

-точность исследования приближается к 100%;

-одинаковая простота идентификации анаэробов и аэробов;

-возможность идентификации микобактерий и плесневых грибов в день обнаружения роста.

Использование масс-спектрометрии в медицине:

-MALDI Biotyper - экспресс идентификация микроорганизмов;

-GENOLINK - генотипирование олигонуклеотидных полиморфизмов и оценка качества олигонуклеотидов;

-CLINPROT - поиск пептидных маркеров заболевания (белковое профилирование);

-ImagePrep - поиск молекулярных маркеров на гистологических срезах (молекулярная гистология);

-ProteinScape – исследования в области протеомики.

Метод матрично-активированной лазерной десорбции / ионизации был разработан для анализа высокомолекулярных соединений в 1985 г. немецкими учеными Францем Хилленкампом и Михаелем Карасом. В этом методе в качестве матрицы использовалось низкомолекулярное органическое соединение. Но для ионизации белков они этот метод не применяли. Дело в том, что при массспектрометрическом методе анализируемая молекула ионизируется и переводится в газовую фазу под действием лазера. Это воздействие приводит к разрушению таких макромолекул как белки.

В 1985 г. Танака Коити запатентовал методику под названием SLD (soft laser desorption) - мягкая лазерная десорбция для масс-спектрометрического анализа. Он предложил использовать тонкий металлический порошок в глицерине в качестве матрицы. В этом случае макромолекулярные аналиты ионизируются без разрушения структуры самого вещества. В 1987 г. он доложил эту методику на ежегодной конференции Японского масс-спектрометрического общества. С этого времени

•

227

•

Коити

Рисунок 226 – Разработчики метода матрично-активированной лазерной десорбции /

(1959) (1936-2014) (1952)

ионизации: а – Танака Коити (род. в 1959 г.); б – Франц Хилленкамп (1936-2014 гг.); в – Михаель Карас (род. в 1952 г.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Сущность метода MALDI-TOF MS состоит в том, что с помощью лазерных импульсов органическое вещество микроорганизмов превращается в заряженные частицы – ионы (ионизация). При этом молекулы вспомогательного вещества (матрицы) и изучаемого белка под воздействием лазера переходят в газовую фазу. Под влиянием электрического поля ионы движутся от источника ионизации к детектору с ускорением, обратно пропорциональным атомным массам. Затем проводится сортировка ионов по массам (по отношению массы к заряду) и построение масс-спектр-графика. Сопоставление полученного спектра с имеющейся базой данных позволяет идентифицировать микроорганизмы. Идентификация микроорганизмов учитывает уникальный для каждого вида микроорганизмов набор белков – своеобразный “отпечаток пальца” (фингерпринтинг), “протеомная дактилоскопия”. Определение спектра белков проводится для бактериальных клеток из изолированной колонии с чашки первичного посева исследуемого материала. Идентификация осуществляется в основном по рибосомальным белкам, которые присутствуют во всех микроорганизмах. Принцип метода представлен на рисунке

227.

Время-пролетная масс-спектрометрия основана на измерении скорости пролёта каждой частицы микроорганизма и выведении на экран результатов “старта” и “финиша”. Вся процедура длится считанные секунды. Для молекул, полученных от разных микроорганизмов, характеристики уже известны, и прибору остаётся сравнить результаты с базой данных. Этот метод позволяет определять больше 4 тысяч видов микроорганизмов.

228

Рисунок 227 – Принцип MALDI-TOF MS. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Методика идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии включает следующие этапы (рисунок 228):

1 этап: подготовка образца (смешивание материала из отдельной колонии с раствором специальной матрицы на подложке масс-спектрометра). Время – 10-33 минуты. В качестве матрицы используют 2',5'-дигидроксибензойная кислота.

2 этап: идентификация (смесь помещают в прибор и подвергают воздействию неносекундных лазерных импульсов) – сравнивание масс-спектра исследуемого

материала со спектрами из базы данных. Время – 12-43 минуты. За 1 загрузку можно идентифицироваПоследовательность192 образца. операций

Шаг 1

Шаг 2

Шаг 3

Идентификация

по базе данных

Получение

масс-спектра

Рисунок 228 – Последовательность операций при масс-спектрометрии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

229

Технология идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF реализована в нескольких анализатора, в том числе в лабораторном комплексе Vitek MS (БИОМЕРЬЕ, Франция). В этом анализаторе на идентификацию одного микроорганизма требуется 2 минуты. Затраты по времени для подготовки 24 изолятов составляют 10 минут, для 96 изолятов – 33 минуты.

Совмещение анализаторов Vitek MS и Vitek 2 позволило компании БИОМЕРЬЕ обеспечить решение двух задач – идентификации бактерий и определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Анализатор Vitek MS (рисунок 229) позволяет проводить идентификацию и определение чувствительности культур к антибиотикам. Микроорганизмы наносятся на слайд, добавляется матрикс и запускается анализ. За 1 загрузку анализируется до 192 образцов.

Рисунок 229 - Анализатор Vitek MS. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Приборное оснащение микробиологических масс-спектрометрических исследований постоянно совершенствуется. Например, времяпролетный МАЛДИ масс-спектрометр Bruker Microflex LT представляет собой настольный вариант для клинических лабораторий (рисунок 230).