Методы исследования в медицинской бактериологии

111

Система позволяет выполнять любой заданный рисунок посева. Рост изолированных колоний отмечается по ходу движения шарика (рисунок 108).

Рисунок 108 – Рост колоний по ходу движения металлического шарика. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

При выделении и культивировании некоторых бактерий применяют дополнительное воздействие физическими и химическими факторами. В частности, при выделении спорообразующих бактерий используют предварительное прогревание материала, йерсинии культивируют при пониженных температурах, для выделения кислотоустойчивых бактерий исследуемый материал обрабатывают кислотой для уничтожения некислотоустойчивых микробов. При выделении спорообразующих бактерий часто используют биопробу: прогретый исследуемый материал вводят подкожно лабораторным животным (белые мыши, морские свинки), после гибели животных производят вскрытие и посев из внутренних органов на питательные среды.

В случае природной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, анилиновым красителям и другим химическим веществам эти соединения добавляют в питательные среды. Эти вещества, угнетая рост одних видов бактерий, не влияют на рост других. На этом принципе основано применение многих элективных сред с красителями: яично-крахмальные среды для выделения микобактерий туберкулеза, глюкозо-печеночная среда с генцианвиолетом (или кристаллвиолетом) для роста бруцелл и подавления роста других видов микроорганизмов.

Для выделения чистой культуры подвижных видов бактерий пользуются методом Мечникова и Шукевича. С этой целью каплю исследуемого материала наносят в нижнюю часть пробирки со скошенным агаром в конденсационную воду. При наличии в материале подвижного микроба через 12-18 часов на поверхности скошенного агара отмечается рост бактерий. Для пересева используют культуру с верхней части агара.

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий имеет определенные особенности. Для культивирования анаэробных микроорганизмов применяют специальные среды: анаэробный кровяной агар с антибиотиками, тиогликолевую

112

полужидкую среду, жидкую среду Китта-Тароцци с кусочками мяса и слоем вазелинового масла на поверхности, среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар) и др. Получить изолированные колонии в жидкой питательной среде невозможно, поэтому вначале используют посев материала штрихом на плотную питательную среду и культивирование посевов в анаэробных условиях (метод Цейсслера). В последующем для накопления чистой культуры анаэробов можно использовать жидкую питательную среду. Характер роста анаэробов в жидких питательных средах представлен на рисунках 109 и 110.

а б в Рисунок 109 – Рост клостридий на среде Китта-Тароцци: а – контроль, б, в - опыт.

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

анаэробы

Рисунок 110 – Рост бактерий на тиогликолевой среде. Стрелками указаны зоны роста культуры. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

113

При выращивании анаэробных бактерий в высоком столбике агара можно разобщить микробные клетки и получить рост изолированных колоний в толще питательной среды. Для этого питательный агар разливают в пробирки, прогревают на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до температуры 45°С, вносят исследуемый материал и тщательно перемешивают. После инкубирования в термостате в толще агара появляются изолированные колонии, для отбора которых столбик агара требуется перенести в чашку Петри и вырезать отдельную колонию (рисунок 111).

Рисунок 111 – Рост анаэробных бактерий в высоком столбике агара. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Исторический интерес представляют такие методы культивирования и получения изолированных колоний анаэробов как метод Вейнберга, метод Перетца, метод Виньяля-Вейона и др. Эти методы до сих пор описывают в учебной литературе. Однако они не используются в практической работе.

Метод Вейнберга заключается в посеве разведений материала в пробирки с расплавленным и остуженным сахарным агаром (рисунок 112).

Рисунок 112 – Получение изолированных колоний анаэробов по методу Вейнберга. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Метод Перетца представляет собой выращивание культуры в слое агара под стеклянной пластинкой, расположенной на двух стеклянных или деревянных палочках (рисунок 113).

114

Рисунок 113 – Метод Перетца. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Метод Виньяля-Вейона предусматривает выращивание культуры в 0,5% агаре в капилляре пастеровской пипетки.

Метод Аристовского представляет собой выращивание культуры в чашках Петри, помещенных в эксикатор с химическим поглотителем кислорода.

Метод “перевернутых чашек” заключается в выращивании культуры на агаре, разлитом в крышку чашки Петри. Сверху крышку закрывают стерильным донышком чашки, а щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафином.

Метод Фортнера (биологический способ культивирования микробов) заключается в совместном культивировании в одной герметически закрытой чашке Петри аэробов и анаэробов. Пока в атмосфере присутствует кислород, растут аэробы, а при снижении концентрации кислорода начинается рост анаэробов (рисунок 114).

Рисунок 114 – Метод Фортнера. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой культуры, в разных полях зрения обнаруживаются морфологически и тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма, присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут встречаться одновременно клетки с различной морфологией.

115

Культивирование микроорганизмов производят в специальных шкафах

– термостатах, в которых постоянно поддерживается необходимая температура. Лабораторный термостат представляет собой шкаф, имеющий снаружи слой теплоизоляционного материала. Термостаты бывают водяные и суховоздушные. В настоящее время наиболее распространенными являются суховоздушные термостаты. Внутри термостатов располагаются сетчатые полки для размещения посевов. Температуру в термостате поддерживают с помощью автоматических терморегуляторов. Внешний вид термостата представлен на рисунке 115.

Рисунок 115 – Лабораторный термостат. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для большинства бактерий оптимальная температура выращивания составляет 36-37ОС. В лабораториях, где проводится большой объем работы, оборудуются специальные термальные комнаты, оснащенные нагревателями.

Признаки роста бактериальных клеток в жидких и на плотных питательных средах характеризуют культуральные свойства микроорганизмов.

В жидкой питательной среде рост микроорганизмов проявляется либо равномерным помутнением среды (диффузный рост культуры), либо образованием осадка (придонный рост культуры), либо формированием пленки на поверхности среды.

Осадок может быть рыхлый, легко разбивающийся при встряхивании пробирки, слизистый, поднимающийся в виде “косички”, либо в виде сплошной массы на дне пробирки. Для некоторых микроорганизмов характерен особый вид осадка. Например, сибиреязвенный микроб формирует осадок в виде нежного комочка ваты.

Пленка на поверхности питательной среды может быть сухой и слизистой, гладкой и складчатой. Для возбудителя туберкулеза характерно образование грубой морщинистой пленки на поверхности среды со свисающими вниз косичками. В ряде случаев бактериальные культуры дают одновременно помутнение среды, обильный осадок и пристеночное кольцо на поверхности.

На плотной питательной среде культуральные свойства определяют по характеру развивающихся колоний. При внесении на поверхность среды большого

116

количества микробных клеток наблюдают сплошной рост бактерий в виде газона. При небольшой концентрации клеток образуются изолированные колонии.

Выросшие изолированные колонии характеризуют по величине, форме, контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции. Величина колоний определяется по ее диаметру. Различают точечные (диаметр менее 1 мм), мелкие (диаметр 1-2 мм), средние (диаметр 2-4 мм) и крупные (диаметр 4-6 мм и более) колонии. По форме колонии бывают правильными (круглая форма), неправильными (амебовидная форма), ризоидными (корневидная форма). Характер контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или под микроскопом при малом увеличении. Различают ровные и неровные края колоний. Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Поверхность колонии бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth - гладкий), шероховатые - буквой R (rough – шероховатый). Цвет колоний определяется пигментом, продуцирующим микробом. Большинство патогенных бактерий пигмента не образуют, поэтому их колонии бесцветны или серовато-белого цвета. Пигментообразующие бактерии формируют кремовые, желтые, синие, красные колонии. Консистенцию колонии определяют при взятии из нее части материала бактериальной петлей. Различают вязкие или слизистые колонии, прилипающие и тянущиеся за петлей. Признаки колоний представлены на рисунке 116.

Форма

Профиль

Край

Рисунок 116 – Признаки колоний микроорганизмов. Заимствовано из Интернетресурсов.

К микроорганизмам, продуцирующим пигменты, относятся Staphylococcus aureus (оранжево-желтый пигмент), Pseudomonas aeruginosa (сине-зеленый пигмент), Serratia marcescens (оранжево-красный пигмент), Peptostreptococcus niger

(коричнево-черный пигмент) и другие бактерии (рисунок 117).

118

плотных питательных средах (культуральные признаки), разложение углеводов (сахаролитические или гликолитические свойства), белков (протеолитические свойства) и липидов (липолитические свойства), чувствительность к бактериофагам и антибиотикам, бактериоциночувствительность, токсигенность и другие признаки. Окончательная идентификация чистой культуры основывается на изучении биохимических, генетических, серологических и биологических признаков (таблица

16).

Таблица 16 – Признаки, учитываемые при идентификации бактерий (критерии вида)

Биохимическая идентификация бактерий основана на выявлении определенных ферментов по способности разлагать те или иные субстраты. Для такой идентификации требуется чистая культура бактерий. Получение чистой культуры бактерий продолжается в течение 2 суток. Процесс биохимической идентификации чистой культуры занимает в среднем 18-24 часа. Таким образом, результат идентификации возможен, в крайнем случае, через 3 суток. При биохимической идентификации выявляют ферменты, разлагающие углеводы (сахаролитические ферменты), белки (протеолитические ферменты), липиды (липолитические ферменты), окислительно-восстановительные ферменты. Дополнительно на соответствующих питательных средах можно определить наличие ферментов – токсинов (гемолизина, плазмокоагулазы и др.).

119

Согласно международной биохимической классификации в зависимости от катализируемой реакции выделяют 6 основных классов ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Отдельные представители каждого класса ферментов имеют систематическое название, а также четырехуровневый числовой код, который отражает класс, подкласс, под-подкласс и серийный номер фермента в под-подклассе. Кроме систематического названия ферменты микроорганизмов в зависимости от субстратной специфичности имеют традиционные (тривиальные) названия: сахаролитические, протеолитические, липолитические, окислительно-восстановительные ферменты, а также ферментытоксины, которые определяют с помощью специальных сред или тестов. Возможности биохимической идентификации бактерий на питательных средах представлены в таблице 17.

Таблица 17 – Биохимическая идентификация бактерий

120