
Методы исследования в медицинской бактериологии
.pdf
31
Рисунок 22 – Бактериологические шпатели. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Подготовленные принадлежности стерилизуют в специальных цилиндрических решетчатых корзинах или в биксах (рисунок 23).
а б Рисунок 23 – Биксы без бактериального фильтра (а) и с бактериальным фильтром
(б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Стерилизацию подготовленных материалов проводят, как правило, в паровых стерилизаторах (автоклавах) с вертикальной или горизонтальной загрузкой (рисунок 24).
Рисунок 24 – Различные марки паровых стерилизаторов. Заимствовано из Интернетресурсов.
32
Косновному оборудованию бактериологических лабораторий относятся также штативы, колбы, световые и люминесцентные микроскопы, термостаты и др.
Всовременных бактериологических лабораториях широкое распространение получают автоматизированные системы, например, система WASP (автоматизированная система посева клинических образцов, Copan, Италия), система BD Phoenix 50 (автоматизированная система идентификации микроорганизмов и определения антибиотикочувствительности, Becton Dickinson, США); система ADAGIO (анализатор антибиотикограмм ДДМ, Bio-Rad, США); система MALDI Biotyper (система быстрой идентификации микроорганизмов, Bruker Daltonik, Германия); система Anoxomat (система для создания специальной атмосферы, Advanced Instruments Inc., США).
Квспомогательному оборудованию относятся боксы микробиологической безопасности, холодильники, морозильники, микробиологические инкубаторы,
сухожаровые шкафы, СО2-инкубаторы, весы, рН-метры, шейкеры, центрифуги, системы очистки воды и др.
2.4. Приемы асептической работы с микроорганизмами
При работе в микробиологической лаборатории необходимо соблюдать правила асептики, препятствующие с одной стороны загрязнению чистой культуры бактерий посторонними микроорганизмами и с другой стороны - распространению микробов во внешней среде.
Асептическое извлечение микробной культуры бактериологической петлей из пробирки производится следующим образом (рисунок 25):
-поставить в штатив пробирку с исследуемой культурой и бактериологическую петлю ручкой вниз;
-зажечь горелку;
-взять левой рукой пробирку как карандаш пробкой вверх, правой рукой - бактериологическую петлю за ручку кольцом вниз;
-профламбировать петлю, прокалив ее до красного каления, и держатель петли в пламени горелки;
-над пламенем горелки извлечь из пробирки пробку, прижав ее к ладони правой руки;
-над пламенем ввести петлю в пробирку, прикоснуться ею к стенке пробирки для охлаждения, погрузить петлю в культуру или прикоснуться к газону культуры на поверхности среды;
-извлечь петлю с культурой, профламбировать край пробирки и пробку, вставить пробку в пробирку, поставить пробирку в штатив;
-каплю культуры с петли использовать по назначению;
-профламбировать бактериологическую петлю и поставить ее в штатив ручкой вниз.

33
Рисунок 25 – Схема асептического извлечения культуры микробов из пробирки бактериологической петлей. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Асептическое извлечение микробной культуры бактериологической петлей с питательного агара из чашки Петри:
-поставить бактериологическую петлю в штатив, чашку Петри с культурой - перед спиртовкой;
-профламбировать петлю;
-приоткрыть покровную чашку, удерживая ее большим и средним пальцами левой руки;
-прикоснуться петлей к среде рядом с колонией, из которой предполагается взять микробную массу, для охлаждения петли;
-прикоснуться петлей к колонии микробов;
-закрыть чашку.
Аналогично извлекают микробную культуру из пробирки и чашки Петри бактериологической иглой. Извлеченная культура используется в основном для приготовления мазков для микроскопирования.
Асептическое извлечение жидкой микробной культуры пипетками
производится следующим образом (рисунок 26):
-поставить в штатив пробирку с культурой;
-положить рядом пенал со стерильными пипетками;
-зажечь горелку;
-извлечь пипетку и взять ее в правую руку как карандаш тонким концом
вниз;

34
-взять пробирку с культурой левой рукой как карандаш, извлечь над пламенем спиртовки пробку, прижав ее мизинцем к ладони правой руки;
-опустить пипетку в наклоненную пробирку, погрузить его в жидкую культуру; после заполнения культурой части пипетки, плотно закрыть ее толстый конец указательным пальцем правой руки, извлечь пипетку с культурой;
-профламбировать край пробирки и пробку, закрыть пробирку пробкой, поставить пробирку в штатив;
-вылить культуру из пипетки по назначению (на стекло, в среду);
-поместить пипетку в дезраствор.
Рисунок 26 – Асептическое извлечение жидкой культуры пипеткой Пастера. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Наполнение пипетки Пастера жидкой культурой осуществляется за счет капиллярных сил, а слив - под действием силы тяжести. Для наполнения пипеток больших объемов (мерных пипеток, пипеток Мора) необходимо создавать разрежение, а для слива - давление. Это достигается специальными приспособлениями (резиновыми баллончиками, дозаторами и пр.). В современных лабораториях широкое распространение получают автоматические пипетки со стерильными съемными наконечниками.
Пересев культуры микробов из пробирки в пробирку (рисунок 27)
производится в следующей последовательности:
-поместить в штатив бактериологическую петлю, пробирки с культурой и со средой, подписать их;
-зажечь горелку;
-взять пробирки как карандаш в левую руку и разъединить их на 1-1,5 см средним пальцем;
-профламбировать бактериологическую петлю; затем края пробирок; извлечь пробки из пробирок правой рукой, зажав одну пробку между ладонью и мизинцем, вторую - между мизинцем и безымянным пальцами;
-ввести бактериологическую петлю в пробирку с культурой, прикоснуться петлей к стенке для охлаждения;
-погрузить петлю в культуру, извлечь каплю и перенести ее в питательную
среду;

35
-извлечь петлю;
-профламбировать края пробирок и пробки и закрыть ими пробирки;
-профламбировать петлю и поставить ее в штатив.
Рисунок 27 – Пересев культуры микробов из пробирки в пробирку. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Пересев культуры микробов из пробирки в чашку Петри (рисунок 28)
производится в следующей последовательности:
-поместить пробирку с культурой и бактериологическую петлю в штатив, а чашку – перед горелкой;
-зажечь горелку;
-взять левой рукой пробирку с культурой как карандаш;
-профламбировать петлю;
-профламбировать край пробирки, правой рукой извлечь пробку, прижав ее мизинцем к ладони правой руки;
-опустить бактериологическую петлю в пробирку, прикоснуться к стенке, извлечь каплю культуры;
-профламбировать край пробирки и пробку, закрыть пробирку пробкой и поставить ее в штатив;
-приподнять большим и средним пальцами левой руки крышку чашки Петри, прикоснуться петлей к среде у края под левой ладонью, провести параллельные штрихи от края до края (на расстоянии 3 мм) вплоть до края правой руки, извлечь петлю, накрыть чашку крышкой;
-профламбировать петлю, поместить ее в штатив;
-поместить чашку Петри в термостат вниз крышкой.

36
Рисунок 28 – Посев на плотную питательную среду в чашку Петри. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Пересев микробной культуры в питательную среду с помощью пипетки
проводится следующим образом:
-поместить в штатив пробирки с культурой и питательной средой;
-зажечь горелку;
-извлечь пипетку из пенала (обертки) правой рукой, взяв ее как карандаш;
-взять левой рукой пробирки, как карандаш, разъединив их средним пальцем и извлечь над пламенем горелки пробки;
-опустить пипетку в микробную культуру;
-после накопления пипетки требуемым объемом культуры, закрыть ее тупой конец указательным пальцем;
-извлечь пипетку с культурой из пробирки и перенести ее в пробирку с питательной средой;
-погрузить конец пипетки в среду, отпустить палец и вылить культуру;
-профламбировать края пробирок и закрыть их пробками;
-пипетку поместить в дезраствор, пробирки поставить в штатив.
Посев культуры микроба на поверхность плотной питательной среды шпателем Дригальского (рисунок 29):
-поместить в штатив стерильную мерную пипетку, развернув бумагу с тупого конца, стерильный шпатель Дригальского, перед спиртовкой - чашку Петри с питательной средой;
-взять левой рукой пробирку с культурой, правой рукой - стерильную пипетку с резиновой грушей;
-извлечь пробку из пробирки, прижав ее мизинцем к ладони, профламбировать край пробирки и пробку;
-профламбировать пипетку, опустить ее в пробирку, набрать культуру, извлечь пипетку;
-профламбировать край пробирки и пробку, закрыть пробирку пробкой, поставить ее в штатив;
-приоткрыть крышку чашки Петри, вылить на среду определенный объем культуры, закрыть чашку крышкой;
-пипетку погрузить в дезраствор;
-извлечь из бумаги стерильный шпатель Дригальского, приоткрыть крышку
итщательно растереть каплю по всей поверхности среды, закрыть чашку;
-профламбировать шпатель или поместить его в дезинфицирующий раствор.

37
Рисунок 29 – Схема посева культуры микроба на поверхность плотной питательной среды шпателем Дригальского. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Посевы в пробирках помещают в штативы, чашки Петри с посевами размещают на поддонах или в лотках. Посевы инкубируют в термостате в большинстве случаев при температуре 36ОС в течение 18-24 часов.
38
3. Правила отбора, хранения и транспортировки материала для микробиологического исследования
Отбор, хранение и транспортировка материала составляют так называемый преаналитический этап лабораторных исследований. Правила отбора, хранения и транспортировки материала для микробиологических исследований регламентированы:
-Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 53079.4-2008 “Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа”;
-МУ 4.2.2039-05 “Техника сбора и транспортировки биоматериалов в микробиологические лаборатории”.
В микробиологических исследованиях используют разные виды материалов: клинический материал из организма больного или носителя, пробы из объектов внешней среды, пробы пищевых продуктов, лекарственных и косметических препаратов и др. Материал для культурального исследования из организма больного отбирается из мест локализации патологического процесса. В качестве клинического материала из организма больного могут быть использованы гной, кровь, мокрота, испражнения, моча, промывные воды, ликвор, рвотные массы, смывы с кожи и слизистых оболочек и другие жидкости и ткани организма. Пробами из объектов внешней среды могут служить вода, воздух, почва, продукты питания, смывы с предметов и др.
Материал для исследования отбирают с соблюдением правил асептики. При лабораторной диагностике инфекционных заболеваний необходимо отбирать материал до начала антимикробной терапии. Для взятия проб следует использовать стерильные инструменты, а для их транспортировки - стерильные пробирки или контейнеры. Использование нестерильных сухих, чистых пробирок допускается только для отбора и транспортировки крови на серологические исследования. Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования.
Для взятия и транспортировки биологического материала следует использовать одноразовые стерильные тубсеры (пробирки с тампонами) промышленного производства или транспортные системы со средой. Нативный материал доставляют в лабораторию в максимально короткие сроки (для большинства образцов не позднее 1,5-2 часов после их получения). Допускается хранение материала в холодильнике при 4ОС. При использовании транспортных сред биологический материал можно хранить в течение 24 часов. Жидкий биологический материал можно транспортировать непосредственно в шприце, на кончик которого надет стерильный колпачок.
Для исследования на анаэробы биологический материал помещают в анаэробные условия. Для жидких образцов (кровь, гной, экссудат, жидкости из стерильных полостей) используют специальные флаконы с жидкой питательной средой, заполненные газовой смесью определенного состава, куда из шприца уколом иглы через резиновую крышку вносят материал.
Транспортировка осуществляется в металлических биксах (пеналах), термоконтейнерах, которые должны легко подвергаться обработке.

39
К отобранному материалу прилагают сопроводительный документ, где указывают наименование, источник и метод получения биологического материала, дату и время его взятия; фамилию, имя и отчество, пол и возраст больного; название учреждения, отделения, номер палаты; предполагаемый диагноз и предшествующую антибактериальную терапию; фамилию и подпись врача, направившего материал для проведения бактериологического исследования.
Гной отбирают из очагов инфекции пункцией шприцем, а из открытых очагов – пипеткой или сухим тампоном.
Слизь из зева и носа отбирают стерильным тампоном (рисунок 30).
Рисунок 30 – Тампоны и транспортные среды для отбора проб. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Полученный материал с тампона немедленно высевают на плотные питательные среды, а также наносят на предметное стекло, подсушивают и направляют в лабораторию.
Мокроту собирают в утренние часы после полоскания рта кипяченой водой. Мокрота собирается после откашливания в стерильную сухую банку с крышкой.
Кровь отбирают шприцем и разводят жидкой питательной средой в соотношении 1:10 с соблюдением правил асептики. Среду выбирают в зависимости от биологических особенностей возбудителя предполагаемой инфекции. В настоящее время кровь для бактериологического исследования отбирают стерильной вакуумной системой для забора крови одноразового использования (рисунок 31).
Рисунок 31 – Вакуумные системы и отбор крови для исследования. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

40
Для получения гемокультуры материал отбирают непосредственно во флаконы, содержащие одновременно плотную и жидкую питательные среды, так называемые двухфазные системы (рисунок 32).
Рисунок 32 – Флакон с двухфазной системой. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для получения сыворотки крови или плазмы для серологических исследований кровь берут натощак в количестве 1 мл в чистую пробирку. При постановке серологических реакций допускается повторно замораживать и оттаивать сыворотку до 3 раз при хранении при температуре минус 20ОС. После размораживания сыворотку следует тщательно перемешать
Ликвор отбирают при спинномозговой пункции.
Рвотные массы собирают в стерильные банки с притертыми пробками и нейтрализуют 10% раствором карбоната натрия (кальцинированной содой).
Промывные воды желудка собирают в стерильную емкость при промывании желудка стерильным физраствором.
Испражнения (2–3 г) берут стерильным деревянным шпателем или стеклянной палочкой из судна, горшка или непосредственно из прямой кишки с помощью ватных тампонов, металлических петель или через трубку ректоскопа. В судне не должно быть следов дезинфектантов. Для отбора проб испражнений используют стерильные одноразовые контейнеры с ложечкой (рисунок 33).
Рисунок 33 – Посуда для отбора проб испражнений. Заимствовано из Интернетресурсов.