Методы исследования в медицинской бактериологии
.pdf81
Рисунок 68 – Окрашивание капсулы по методу Михина. Заимствовано из Интернетресурсов.
Окраска спор бактерий. Споры с трудом подвергаются окрашиванию. В обычных методах окрашивания споры не прокрашиваются красителями, оставаясь совершенно бесцветными внутри окрасившихся вегетативных клеток. Это позволяет изучать расположение, величину и форму споры. Для прокрашивания спор требуется специальная обработка мазка путем предварительного прогревания в кислоте для размягчения споровых оболочек или протравливания с помощью концентрированных щелочных растворов красок при высокой температуре. Окрашивание спор бактерий проводят методами Циля-Нельсена или Ауески (Ожешко).
При окрашивании спор по методу Ауески (Ожешко) на предметном стекле готовят густой мазок исследуемой культуры, высушивают его и, не фиксируя, наливают на него 0,5% раствор соляной кислоты. Препарат подогревают в течение 2 минут до появления паров. Кислоту сливают. После этого препарат промывают водой, высушивают и фиксируют. Далее препарат окрашивают по методу ЦиляНельсена. Для этого на препарат помещают полоску фильтровальной бумаги и наносят несколько капель карболового фуксина Циля. Препарат вновь подогревают на пламени спиртовки до появления паров. Затем препарат обесцвечивают 5% серной кислотой и докрашивают дополнительно метиленовой синькой в течение 3-5 минут. Споры окрашиваются фуксином в ярко-красный цвет, а вегетативные клетки обесцвечиваются серной кислотой и окрашиваются метиленовой синькой в синий цвет (рисунок 69).
Рисунок 69 – Окраска спор Bacillus cereus методом Ауески. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
82
Окрашивание спор по методу Златогорова. Мазок фиксируют над пламенем горелки. Затем на поверхность мазка помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной основным феноловым фуксином Циля. Бумагу смачивают 3-5 каплями воды. Препарат подогревают в течение 5-7 минут, обесцвечивают 3% водным раствором серной кислоты в течение 5-10 секунд и промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят метиленовым голубым в течение 2-3 минут, после чего мазок промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки - в синий.
Окрашивание спор по Пешкову. После фиксации препарата над пламенем горелки мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 15-20 секунд, подогревая над пламенем спиртовки. Препарат промывают водой. Дополнительное окрашивание проводят 0,5% водным раствором нейтрального красного в течение 30 секунд. Затем препарат промывают водой и высушивают. При этом методе споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий или фиолетовый цвет (рисунок 70).
Рисунок 70 – Окраска спор по методу Пешкова. Заимствовано из Интернетресурсов.
Окрашивание жгутиков по методу Лайфсона. Для окраски жгутиков используют три основных раствора: основный фуксин в 95% этиловом спирте – 1,2%, таниновая кислота в дистиллированной воде – 3%, хлористый натрий в дистиллированной воде – 1,5%. Краску готовят, смешивая равные части трех основных растворов. На высушенный препарат бактерий с помощью пастеровской пипетки наносят 1 мл краски и окрашивают в течение 5 - 15 минут. Осадок краски на жгутиках делает их толще и окрашивает в красный цвет (рисунок 71).
83
Рисунок 71 – Жгутики Bacillus cereus, окраска по Лайфсону. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Окрашивание жгутиков бактерий по методу Леффлера (щелочным метиленовым синим). Взвесь бактерий вносят в каплю воды (не размазывая ее петлей), нанесенную на предметное стекло, и дают высохнуть. Для обеспечения сохранности жгутиков необходимо чрезвычайно осторожное обращение с мазком во время всех манипуляций. Обрабатывают 15-20 минут при комнатной температуре протравой следующего состава: 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина и смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа (протраву готовят за несколько суток до употребления; перед употреблением ее отфильтровывают). Препарат тщательно промывают водой, высушивают на воздухе. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при легком подогревании (без образования паров). Затем препарат промывают водой, высушивают над пламенем горелки. Жгутики окрашиваются в красный цвет.
Окрашивание жгутиков по Морозову (серебрение). Предварительно осторожно готовят взвесь культуры бактерий в 1% растворе формалина. Несколько капель полученной взвеси наносят на предметное стекло. Капли высушивают на воздухе, не распределяя их по поверхности стекла. Затем на высушенный препарат наносят ледяную уксусную кислоту с формалином на 1 минуту. Остаток протравы сливают, и препарат промывают водой. После подсыхания на препарат наносят раствор танина с карболовой кислотой и в течение 1 минуты препарат прогревают над пламенем горелки до появления паров. Препарат снова промывают водой. На подсушенный препарат наносят раствор нитрата серебра и выдерживают до появления темно-коричневой окраски. Окрашенный препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют. Тела микробных клеток окрашиваются в черный цвет, жгутики приобретают коричневый цвет (рисунок 72).
84
Рисунок 72 – Окраска жгутиков бактерий по Морозову. Заимствовано из Интернетресурсов.
Окрашивание зерен волютина по методу Нейссера. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синькой в течение 1 минуты. Затем краску сливают, препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя в течение 20-30 секунд. Не промывая водой, мазок окрашивают везувином в течение 10-15 секунд. Затем препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет (рисунок 73).
Рисунок 73 – Окраска зерен волютина в клетках C. diphtheriae по Нейссеру. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Окрашивание зерен волютина методом Омелянского. Приготовленный мазок фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 30 секунд карболовым фуксином Циля. После промывания мазок обесцвечивают 1% раствором серной кислоты в течение 20-30 секунд. Затем мазок вновь промывают водой и дополнительно окрашивают слабым раствором метиленового голубого (1:40) в течение 15-20 секунд. Микроскопическая картина: гранулы волютина красные, цитоплазма синяя.
Окрашивание гликогена проводится путем добавления к капле культуры такого же количества раствора Люголя. При соединении с раствором Люголя гликоген приобретает красно-бурую окраску.
85
Окрашивание зерен гранулезы осуществляется следующим образом. К капле микробной культуры добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом. Под иммерсионной системой микроскопа видны микробные клетки и окрашенные в синий цвет зерна гранулезы.
Окрашивание капель жира производят спиртовым раствором Судана III (0,05 г Судана III в 100 мл 96% этилового спирта). Для этого к капле культуры добавляют краситель и тщательно перемешивают. Препарат высушивают и микроскопируют. Капли жира окрашиваются в красный цвет, а цитоплазма бактерий остается неокрашенной.
Более демонстративно окрашивается жир при добавлении к капле культуры 40% раствора формалина. Через 5 минут после этого на препарат наносят каплю метиленового голубого (1:40), а по истечении 10 минут столько же Судана III. Капли жира принимают розовую или оранжевую окраску, цитоплазма клетки - синюю.
Для выявления отдельных структур бактериальной клетки применяют и другие сложные методы окрашивания (таблица 10).
Таблица 10 – Сложные методы окрашивания клеточных структур бактерий
Структура бактерий |
Метод окрашивания |
Вид препарата |
Клеточная стенка |
У некислотоустойчивых – |
Грамположительные бактерии |
|
метод Грама |
– фиолетовые |
|
|
Грамотрицательные бактерии - |
|
|
розовые |
|
У кислотоустойчивых – метод |
Кислотоустойчивые бактерии – |
|
Циля-Нельсена |
красные |
|
|
Некислотоустойчивые |
|
|
бактерии - синие |
Споры |
Метод Ауески |
Споры – красные |
|
|
Вегетативные клетки - синие |
Капсула |
Метод Бурри-Гинса |
Капсула бесцветная |
|
|
Микробная клетка - красная |
Жгутики |
Метод Морозова |
Жгутики – светло-желтые |
|
|
Микробная клетка – темно- |
|
|
коричневая |
Нуклеоид |
Метод Романовского-Гимзы |
Нуклеоид – фиолетовый |
|
|
Цитоплазма – бледно-розовая |
Зерна волютина |
Метод Нейссера |
Зерна волютина – синие |
|
|
Микробная клетка - желтая |
Фазово-контрастная микроскопия (метод фазового контраста)
представляет собой метод микроскопического исследования малоконтрастных неокрашенных объектов, не видимых при обычной световой микроскопии (например, неокрашенных живых бактерий). Для фазово-контрастной микроскопии используют специальное устройство, состоящее из фазового конденсора, фазовых объективов, вспомогательного микроскопа и светофильтров. Получаемое изображение называется фазово-контрастным (рисунок 74).
86
Рисунок 74 – Фазово-контрастная микроскопия Bacillus cereus. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
При темнопольной микроскопии (при использовании метода темного поля) объект освещается сбоку, поэтому исследователем воспринимаются отраженные лучи. При темнопольной микроскопии можно обнаружить частицы, которые при светлопольной микроскопии не видны. При темнопольной микроскопии изучают движение живых неокрашенных бактерий, например, спирохет. Препарат для темнопольной микроскопии готовят методом “раздавленная” или “висячая” капля. Неосвещенное поле зрения остается темным, а бактерии выглядят ярко светящимися (рисунок 75).
Рисунок 75 – Treponema pallidum при исследовании методом темнопольной микроскопии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
При темнопольной микроскопии можно увидеть только контуры объекта, но невозможно изучить их структуру.
Фазово-контрастная и темнопольная микроскопия позволяют провести прижизненное изучение микроорганизмов.
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на явлении люминесценции (флюоресценции) - способности объекта под влиянием падающего света (сине-фиолетового света или ультрафиолетовых лучей) испускать лучи с большей длиной волны и другого цвета. При люминесцентной микроскопии используют как естественную (первичную, собственную) люминесценцию микробов, так и искусственную (вторичную, наведенную) люминесценцию. Собственная люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания изучаемого объекта специальными красителями. Большинство биологических
87
объектов имеют неяркую собственную люминесценцию, поэтому для их изучения используют вторичную люминесценцию. Вторичная люминесценция возникает после окраски препарата специальными люминесцирующими красителями (флюорохромами, люминофорами), которые способны связываться со специфическими структурами бактериальных клеток. Например, акридиновый оранжевый связывается с нуклеопротеидами клетки, аурамин – с воскоподобными веществами. В люминесцентном микроскопе имеется система светофильтров, пропускающих определенные лучи и задерживающих остальные. При люминесцентной микроскопии наблюдаемые объекты выглядят в виде светящихся форм (рисунок 76).
Рисунок 76 – Люминесцентная микроскопия микобактерий туберкулеза (палочки желтого цвета). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Люминесцентная микроскопия используется как метод экспрессдиагностики, она проводится в прямом и непрямом вариантах. Исследование носит ориентировочный характер.
В последние годы широко используется иммунолюминесцентная микроскопия – реакция иммунофлюоресценции (РИФ) с применением специфических иммуноглобулинов, меченых флюорохромами. В качестве метки чаще всего используют флуоросцеина изотиоцианат (ФИТЦ). Комплекс “антитело + ФИТЦ” позволяет выявлять в РИФ очень низкие концентрации микробных клеток (рисунок 77).
Рисунок 77 – Выявление пневмококков с помощью РИФ. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
88
Преимуществами люминесцентной микроскопии являются цветное изображение изучаемого объекта, выявление в исследуемом материале микроорганизмов в небольшой концентрации, возможность использования люминесцентной микроскопии в качестве экспресс-метода обнаружения и идентификации конкретных антигенов (возбудителей).
Электронная микроскопия используется в основном в научноисследовательских лабораториях, так как требует наличия дорогостоящего оборудования, специфической подготовки препаратов для исследования и квалифицированного персонала. Оснащение кабинета электронной микроскопии представлено на рисунке 78.
Рисунок 78 – Оснащение кабинета электронной микроскопии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
В электронно-микроскопических исследованиях используют
просвечивающую (трансмиссионную) и сканирующую электронную микроскопию |
|
(рисунок 79). |
Электронная микроскопия |
|
а |
б |
Просвечивающая |
Сканирующая |
Рисунок 79– Препараты бактерий, полученные при просвечивающей (а) и |
|
электронная микроскопия |
электронная микроскопия |
сканирующей (б) электронной микроскопии.
При просвечивающей (трансмиссионной) микроскопии ультратонкие срезы клеток обрабатывают солями тяжелых металлов (свинца, ртути, хрома, вольфрама), позволяющими сделать изображение контрастным. Для выявления окислительновосстановительных ферментов используют теллурит калия или соли тетразолия. В трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопах электроны, проходя
89
через образец, частично задерживаются. Прошедшая через образец часть электронной попадает на экран микроскопа и создает изображение. Те участки клетки, которые слабо рассеивают электроны, выглядят на экране светлыми, а те участки, которые сильно рассеивают электроны, выглядят темными.
При сканирующей электронной микроскопии на изучаемые объекты в вакуумной камере напыляют электронно-плотные вещества. В сканирующих электронных микроскопах тонкий пучок электронов сканирует поверхность клетки. Отраженные от поверхности образца электроны собираются и образуют на экране объемное изображение.
Бактериоскопические методы исследования имеют как достоинства, так и недостатки. Основными достоинствами бактериоскопических методов являются простота, доступность, быстрота проведения исследования, экономичность. Основными же недостатками бактериоскопических методов исследования являются низкая чувствительность и низкая специфичность.
90
5.2. Культуральное исследование
Культуральное исследование предусматривает выделение чистой культуры бактерий на питательных средах и ее идентификацию до вида и рода путем изучения морфологических, культуральных, биохимических, генетических, серологических, биологических свойств. Для изучения указанных свойств используют стандартные диагностические схемы, утвержденные Министерством здравоохранения (“Приказ об унификации микробиологических методов исследования №535 от 1985 г.”). Культуральное исследование позволяет установить этиологический диагноз заболевания путем выделения чистой культуры и ее идентификации, определить дополнительные свойства возбудителя (например, чувствительность к антибиотикам), типировать микроорганизмы (определить внутривидовые различия по генетическим и эпидемическим маркерам).
5.2.1. Питательные среды для выделения, культивирования и идентификации бактерий
Культивирование бактерий (накопление микробной биомассы) производится на питательных средах. Облигатные внутриклеточные паразиты (хламидии, риккетсии, вирусы) культивируются исключительно в биологических системах (на культурах клеток, в куриных эмбрионах, в организме чувствительных лабораторных животных).
Культуральное исследование включает в себя посев материала, взятого от больного или с объектов внешней среды, на питательные среды, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию. Для выращивания бактерий используют различные питательные среды. Питательные среды должны содержать питательные вещества в доступной для усвоения форме, иметь оптимальное значение рН, быть стерильными.
Питательные среды классифицируются на группы.
По происхождению выделяют естественные, полусинтетические и синтетические среды. Естественные питательные среды представляют собой природные органические соединения непостоянного состава, которые включают продукты животного или растительного происхождения: пептоны, кровь, экстракты и отвары мяса, рыбы, круп.
Полусинтетические питательные среды кроме органических и неорганических веществ известного состава содержат продукты природного происхождения (картофельная среда с глюкозой, дрожжевая среда, сахарный бульон).
Синтетические питательные среды состоят из определенных количеств органических и неорганических химических соединений известного состава. Их рецептура всегда постоянная.
По составу выделяют простые и сложные питательные среды. В состав простых питательных сред входят источники азота (пептон, мясной экстракт) и соли. К простым (обычным) питательным средам относятся пептонная вода, мясо-