5 Вопрос

Методы выделения индивидуальных белков: избирательное осаждение солями и органическими растворителями, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография

Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8–10% растворах солей. При экстракции белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты – вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.

Из органических соединений, помимо давно применяемых водных растворов глицерина, широко используют (особенно для солюбилизации) слабые растворы сахарозы. На растворимость белков при экстракции большое влияние оказывает рН среды, поэтому в белковой химии применяют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси со значениями рН от кислых до слабощелочных, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Особенно широкое распространение получили трис-буферные системы, представляющие собой смеси 0,2 М раствора трис-(оксиметил)-аминометана (HOCH2)3CNH2(сокращенно обозначают «трис») с 0,1 М раствором хлороводородной кислоты в разных соотношениях. Для выделения белков сыворотки крови используют способы их осаждения этанолом (см. метод Кона), ацетоном, бутанолом и их комбинации. Почти все органические растворители разрывают белок-липидные связи, способствуя лучшей экстракции белков.

Для получения из биологического материала белков в чистом, гомогенном, состоянии применяют различные детергенты, способствующие расщеплению белок-липидных комплексов и разрыву белок-белковых связей . В частности, для освобождения белков (ферментов), прочно связанных с биомембранами митохондрий или других субклеточных структур, применяют тритон Х-100, додецилсульфат натрия и дезоксихолат натрия. детергенты, вызывая разрыв белок-белковых связей, разрушают олигомерную (четвертичную) структуру белков.

Ионная хроматография: основана на разделении белков, различных по суммарному заряду при опред. значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков ч/з хроматографическую колонку часть белков задерживаются в ней в рез-те электростатических взаимодействий. В качестве неподвижной фазы используют ионообменники-органич. вещ-ва содержащие заряженые функциональные группы.

Афинная хроматография:основана на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикрепленными к твердому носителю. В качестве лиганда используется субстрат или кофермент. Ч/з колонку заполненную лигандом пропускают раствор, содержащий смесь белков. К лиганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним.

Гель фильтрация (метод разделения белков по молекулярной массе или метод молекулярного сита): Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля(размером 10-500 мкм) изполимерных материалов. Частицыгеляпроницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Смесьбелковвносят в колонку сгелеми элюируютбуферным раствором. Белковыемолекулы, не способные проникать в гранулыгеля(помечены красным цветом), будут перемещаться с высокой скоростью. Средние (зеленого цвета) и небольшиебелки(синего цвета) будут в той или иной степени удерживаться грануламигеля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций. Объем выхода того или иногобелказависит в основном от егомолекулярной массы.