Контроль діагностикуму

Дослід

Дослідний матеріал

Еритроцитарний антигенний діагностикум

Діагностична імунна сироватка

Схема механізму РГПГА для визначення антигену в досліджуваному матеріалі

Еритроцит

Антиген в дослідному матеріалі

Антитіло діагностичної імунної сроватки

Облік

Додаток І

Постановка реакції зв’язування комплементу (РЗК)

РЗК виконується в дві фази при участі двох систем: бактерійної і гемолітичної. У першій фазі (специфічній) беруть участь антиген + антитіло + комплемент. Комплекс, що утворився не візуалізується. Друга фаза - виявлення комплексу, що утворився, за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана + гемолітична сироватка). Гемоліз відбувається у разі приєднання до гемолітичної системи комплементу. Якщо ж комплемент адсорбувався раніше на комплексі антиген + антитіло в першій системі, то гемоліз еритроцитів не відбувається, еритроцити випадають в осад.

За наявності в досліджуваній сироватці антитіл гомологічних антигену, комплекс (АГ + АТ), що утворився, зв'язує на собі комплемент. При додаванні гемолітичної системи гемолізу еритроцитів не відбувається, оскільки комплемент зв'язується з комплексом АГ + АТ, а еритроцити випадають в осад.

За відсутності в сироватці, яка досліджується, специфічних антитіл до антигена, введеного в першу систему, специфічний комплекс антиген + антитіло не утворюється і комплемент залишається у вільному стані. Тому при додаванні гемолітичної системи комплемент приєднується до неї. Результатом реакції в даному випадку буде гемоліз еритроцитів – в пробірках утворюється так звана «лакова» кров.

Всі компоненти, що беруть участь в реакції, мають бути попередньо відтитровані й взяті в рівних об'ємах.

РЗК ставлять в 5-и пробірках (1,2,3,4,5).

Сироватку, яку досліджують (I), попередньо прогрівають при 56 °С протягом 30 хвилин для інактівації комплементу, який в ній міститься і однією піпеткою вносять по 0,5 мл в 1-у і 5-у пробірки.

Другою піпеткою вносять 0,5 мл позитивної сироватки (II) у 2-у пробірку (контроль).

Третьою піпеткою вносять 0,5 мл негативної сироватки (III) у 3-у пробірку (контроль).

Четвертою піпеткою вносять по 0,5 мл фізіологічного розчину (IV) у 4-у і 5-у пробірки (контроль).

Цією ж піпеткою вносять по 0,5 мл специфічного антигену в робочій дозі (V) в 1-у, 2-у, 3-ю, 4-у пробірки. П'ятою піпеткою вносять по 0,5 мл комплементу в робочій дозі (VI) у всі пробірки.

Окремо готують гемолітичну систему – суміш рівних об'ємів 3% суспензії еритроцитів барана і гемолітичної кролячої сироватки (VII). Інгредієнти необхідно змішувати як найшвидше. Причому гемолітичну сироватку слід додавати до суспензії еритроцитів, а не навпаки. Гемолітичну систему витримують 30 хвилин в термостаті при 37 ° С і шостою піпеткою вносять по 1,0 мл у всі пробірки.

Після додавання гемолітичної системи пробірки поміщають в термостат при 37 ºС до повного гемолізу в контрольних пробірках.

Результат реакції оцінюють за чотирьохплюсовою системою:

+ + + + - відсутність гемолізу

+ + + - гемоліз 25%

+ + - гемоліз 50%

+ - гемоліз 75%.

Для визначення титру специфічних антитіл сироватку, яку досліджують, (I) послідовно двократно розводять фізіологічним розчином.

Титром антитіл в дослідній сироватці вважають найбільше її розведення, що дало затримку гемолізу.

Схема постановки РЗК для виявлення специфічних антитіл в сироватці крові обстежуваного