Мікробіологічна діагностика стрептококових захворювань

Найбільш частими збудниками стрептококових захворювань є: S.pyogenes, S. agalactiae, S. bovis, стрептококи групи C та G, які входять до родини Streptococcaceae, роду Streptococcus.

Матеріалом для дослідження є гній, відокремлюване із зіву та носа, ліквор, мокротиння, кров, сеча, вміст везикул, пустул.

Матеріал відбирають одноразовим шприцом або стерильним ватним тампоном, який поміщають у пробірку із транспортним живильним середовищем (СКС- середовище для контролю стерильності).

Кров для бактеріологічного дослідження в об’ємі 5-10 мл засівають в цукровий бульйон безпосередньо біля ліжка хворого таким чином, щоб співвідношення крові та живильного середовища було б не менш ніж 1:10 – 1:20. Термін передачі патологічного матеріалу в бактеріологічну лабораторію не повинен перебільшувати двох годин.

Мікробіологічну діагностику стрептококових захворювань проводять мікроскопічним, бактеріологічним та серологічним методами.

Мікроскопічний метод. З матеріалу, який досліджується готують мазок і фарбують його за Грамом. При мікроскопії в мазку виявляються грампозитивні коки, які розташовуються короткими ланцюжками, іноді попарно чи у вигляді одиничних коків. На основі вивчення морфологічних і тінкторіальних властивостей неможливо визначити рід виявлених в препараті мікробів.

Для виявлення патогенного стрептококу, в отриманому від хворого клінічному матеріалі, використовують реакцію імунофлюоресценціїї (РІФ). В цьому випадку використовують специфічні сироватки, в яких антитіла проти стрептококів помічені флюорохромом (див. додаток).

Бактеріологічний метод є основним в діагностиці стрептококових захворювань. Взятий для дослідження матеріал висівають в середовище збагачення, в якості якого використовують середовище для контролю стерильності (СКС). Після інкубації в термостаті матеріал, що досліджується пересівають на цукровий бульйон і на 5% кров’яний агар з метою виділення чистої культури мікробів, вивчення культуральних властивостей та виду його гемолізу. Висіви поміщають у ексикатор зі щільно притертою кришкою та запаленою в середині свічкою, або в анаеростат, де створюють підвищену концентрацію двоокису вуглецю. Інкубують в термостаті при температурі 37°С протягом 18-24 годин. На цукровому бульйоні S. pyogenes дає придонно- пристінковий ріст з утворенням дрібнозернистого осаду і збереженням повної прозорості середовища. S. bovis викликає інтенсивне помутніння бульйону з утворенням невеликого гомогенного осаду. У виготовлених з бульйонної культури мазках стрептококи розташовуються звичайно у вигляді типових для них довгих ланцюжків.

На кров’яному агарі стрептококи утворюють дрібні (1-2 мм в діаметрі) прозорі або напівпрозорі колонії сірувато–білого кольору. За типом гемолізу на кров’яному агарі стрептококи поділяють на три групи.

Перша група представлена β-гемолітичними стрептококами, здатними викликати повний лізис еритроцитів (повне просвітлення середовища) навколо колоній. Колонії прозорі, слизові, круглої форми, нагадують краплі роси. Це характерно для свіжовиділених штамів S. pyogenes. Блискучі колонії характерні для багатьох штамів S.agalactiae.

Друга група представлена α-гемолітичними стрептококами, які викликають на кров’яному агарі неповний гемоліз у вигляді напівпрозорої зони зеленуватого відтінку. Зеленящі стрептококи ростуть у вигляді дрібних колоній сіруватого кольору з гладкою чи шорсткою поверхнею. Такий ріст характерний для багатьох видів стрептококів, вегетуючих на слизовій оболонці порожнини рота (S.salivarius, S. mutans, S.oralis и др.)

Третя група представлена негемолітичними γ-стрептококами. Вони не викликають змін кров’яного агару у процесі свого росту, мають слабко виражену вірулентність.

З підозрілих колоній готовлять мазки, фарбують за Грамом і мікро- скопують. Колонії, які виросли на кров’яному агарі, пересівають на скошений кров’яний агар. Висіви інкубують в термостаті при температурі 37°С на протягом 18- 24 годин. З метою перевірки чистоти виділеної культури, з мікробного нальоту, що виріс на скошеному агарі готовлять мазок, фарбують за Грамом, мікроскопують. У випадку, коли культура мікробів чиста, продовжують вивчати їх біохімічні та антигенні властивості. Для встановлення видової приналежності стрептококів найбільше значення мають наступні тести: тип гемолізу на кров’яному агарі, проба на каталазу, чутливість до бацитрацину й сульфаніламідів (сульфаметоксазолу та триметоприму), жовчно-ескуліновий тест, ріст в бульйоні з 6,5% NaCl, наявність піролідоніларіламідази (PYR), гідроліз гіпурату натрію.

Проба на каталазу. Тест заснований на здатності мікроорганізмів, які мають цей фермент, розщеплювати перекис водню з утворенням кисню і води. Для постановки цього тесту чисту культуру поміщають у краплину 3-10% розчину перекису водню на предметному склі і розтирають круговими рухами. В позитивному випадку спостерігають виділення пухирців газу. На відміну від стафілококів, стрептококи не мають цього ферменту.

Проба с бацитрацином і сульфаніламідами. Для попередньої ідентифікації S.pyogenes і β-гемолітичних стрептококів груп C та G використовують два паперових диски, один з яких просякнутий розчином антибіотика бацитрацина, а другий – сумішшю сульфаметоксазола та триметоприма. Диски поміщають на чашку з кров’яним агаром, засіяним культурою, яку випробовують та інкубують 18-24 години в аеробних умовах. Будь-яка видима зона затримки росту навколо дисків інтерпретується як чутлива до цих антимікробних препаратів. Абсолютна більшість штамів S. pyogenes чутлива до бацитрацину, а стрептококи груп С і G – до сульфаніламідів.

Жовчно–ескуліновий тест. Використовується для попередньої ідентифікації стрептококів S.bovis, які ростуть на жовчно-ескуліновому агарі з утворенням колоній темно–брунатного чи чорного кольору.

Ріст в бульйоні з 6,5% розчином NaCl. S.agalactiae на відміну від інших стрептококів стійкий до високої концентрації хлористого натрію і дає ріст в бульйоні через 24-48 години інкубації в термостаті при температурі 37°С.

PYR – тест. В основі тесту лежить виявлення ферменту піролідоніламідази, яка є у більшості штамів S. pyogenes і не зустрічається в інших стрептококів. Культуру, яку досліджують, петлею вносять в живильний бульйон, що містить 0,01% L-піролідоніл-β-нафтиламіду та інкубують при температурі 37°С протягом 4 годин. Після додавання однієї краплі діметиламіноациннамальдегіда в позитивному випадку з’являється яскраво-червоне забарвлення.

Гідроліз гіпурату натрію. В основі даного тесту лежить здатність S. agalactiae викликати гідроліз гіпурату натрію. Виділену чисту культуру з допомогою петлі диспергують у 1% водному розчині гіпурату натрію. Через 2 години інкубації при температурі 37°С додають 3,5% розчин нінгідрину у суміші бутанолу і ацетону (1:1). При позитивному результаті після інкубації на протязі 10 хв. з’являється пурпурне забарвлення.

Диференціація стрептококів за антигенною структурою. Ґрунтується на виявленні полісахаридного антигену клітинної стінки стрептококу. Наприклад застосовують реакцію преципітації з групоспецифічними сироватками груп А, В, С, G. Ці сироватки наливають у 4 вузькі преципітаційні пробірки. Екстракт, отриманий після обробки центрифугату чистої культури стрептококу розчином хлористо–водневої кислоти, обережно, не зміщуючи рідини, нашаровують на групоспецифічні сироватки. При позитивній реакції на межі двох рідин з’являється біле кільце. Звичайно реакція преципітації виникає через 5-30 хв.

Серологічний метод діагностики стрептококових захворювань знайшов використання у разі встановлення діагнозу ревматизму. Для цього в сироватці крові хворого визначають титр антитіл до екстрацелюлярних продуктів стрептококу – стрептолізину-О. Досліджують парні сироватки хворого з інтервалом 7-10 діб. Препарат стрептолізин-О, який випускають у сухому вигляді, розчинюють та вносять в кожну пробірку з розведеною сироваткою. У день постановки досліду готують 5% завись еритроцитів дефібринованої крові кролика і також вносять в кожну пробірку.

Реакція базується на нейтралізації здатності стрептолізину-О розчиняти еритроцити in vitro у випадку присутності в сироватці хворого антитіл проти стрептококу (антистрептолізина-О). Максимально розведена сироватка у пробірці забезпечує затримку гемолізу еритроцитів і вказує на відповідну кількість антистрептолізину-О.

Титр антистрептолізина-О у практично здорових осіб не перевищує 250 міжнародних одиниць. При гострих і хронічних стрептококових інфекціях він наростає, причому за наявності ревматизму чи нефриту з перших днів захворювання відмічається дуже високий титр антитіл (500 од. і вище).

Схема „Мікробіологічна діагностика стрептококової інфекції”