Мікробіологічна діагностика дифтерії

Збудник Corynebacterium diphtheriae входить до родини Corynebacteriасеае, роду Corynebacterium. Матеріалом для дослідження є плівки з мигдалин, слиз із зіву й носа, відокремлюване уражених ділянок шкіри й слизових.

Відбирають матеріал двома стерильними ватними тампонами й негайно, не пізніше ніж через 3 години, доставляють до лабораторії.

Мікробіологічну діагностику дифтерії проводять трьома методами: мікроскопічним, бактеріологічним, серологічним.

Мікроскопічний метод. З матеріалу який досліджують, взятого одним тампоном, готують 2 мазки й фарбують їх за Грамом та Нейссером. При фарбуванні за Нейссером в мазках виявляють мікроби паличкоподібної форми, що розташовуються у вигляді римської п’ятірки (V). Палички мають солом'яно-жовтий, а зерна волютина (Бабеша-Ернста) на кінцях - темно-синій колір. Цей спосіб фарбування дозволяє відрізнити Corynebacterium diphtheriae від pseudodiphtheriticum, у яких не виявляються зерна Бабеша-Ернста. Ці результати мікроскопічного дослідження розглядаються як орієнтовні, тому що в препараті можуть бути й інші зернисті мікробні клітини.

При фарбуванні за Грамом зерна волютину не виявляються, але грампозитивне забарвлення й характер розташування дифтерійних паличок, дозволяє побічно відрізнити їх від непатогенних коринебактерій, що розташовуються у вигляді паркану, тобто паралельно одна одній.

Бактеріологічний метод. Є основним методом діагностики дифтерії. Він включає виділення чистої культури мікробів, ідентифікацію їх, обов'язкову перевірку здатності виділеної культури коринебактерій виробляти екзотоксин.

Матеріал, який досліджується, взятий другим тампоном, висівають на телуритові сироваткові чи кров'яні середовища в чашках Петрі й поміщають у термостат. В залежності від біовару на кров'яному телуритовому агарі можуть вирости великі колонії сірувато-чорного кольору, пласкі, шорсткуваті, радіально розкреслені, з зубчастими краями (gravis), дрібні опуклі блискучі чорні колонії з гладенькою поверхнею та рівними краями (mitis), дрібні пласкі колонії з більш темним центром, іноді з нерівними краями (intermedius).

Для одержання чистої культури мікробів частину підозрілої колонії пересівають на скошену згорнуту сироватку (середовище РУ, Леффлера). Після інкубації в термостаті на сироватковому агарі спостерігається ріст дифтерійної палички у вигляді «шагреневої шкіри» (колонії мікроорганізмів зливаються, але центр їх залишається підвищеним). Визначивши під мікроскопом чистоту виділеної культури, ідентифікують мікроорганізми шляхом вивчення біохімічних властивостей для чого їх висівають у середовище Гісса (глюкоза, лактоза, маніт, мальтоза, цукроза), у середовище з крохмалем, глікогеном.

Для виявлення цистинази дифтерійних паличок роблять висів у спеціальне середовище з цистином й оцтовокислим свинцем. Відзначають почорніння середовища по ходу висіву.

Для визначення здатності мікроба розщеплювати сечовину роблять висів у бульйон з 1% сечовини й індикатором крезолрот. Почервоніння середовища не відзначають, оскільки збудники дифтерії не мають уреазної активності.

Токсигенність дифтерійної палички можна виявити як in vivo, так і in vitro.

In vivo. Морським свинкам внутрішньошкірно вводять фільтрат бульйонної культури дифтерійних бактерій. Якщо мікроби виробляють екзотоксин, то в місці введення культури утвориться некроз тканини.

Найбільше поширення отримали досліди in vitro. При цьому використовують реакцію преципітації в гелі (див. додаток). На поверхню живильного середовища в центрі чашки Петрі розміщують смужку фільтрувального паперу, просякнутого антитоксичною протидифтерійною сироваткою. Культури мікробів, які досліджуються, висівають бляшками з обох боків смужки. Контролем є відомий токсигенний штам дифтерійної палички. Чашки з висівами інкубують при t 37 °С, результати враховують через 24-48 годин. Якщо дифтерійні палички продукують екзотоксин, то він дифундуючи в агар і зустрічаючись з антитоксином, утворює чітку лінію преципітату, що зливається з лінією преципітату токсигенного (контрольного) штаму.

Вивчення перерахованих вище властивостей виділеної культури дозволяє відрізняти дифтерійну паличку від інших коринебактерій (дифтероїдів і псевдодифтерійних ).

Диференційні ознаки коринебактерій

Види коринебактерій	Цистиназа	Уреа-за	Глюкоза	Цук-роза	Крохмаль	Токсиген-ність
С. diphtheriae	+ +	–	+	– (іноді +)	– (mitis) + (gravis)	+ (–)
C. xerosis	– (+)	+ (–)	+	+	–	–
С.рseudodiphtheriticum	–	+	–	–	–	–

Серологічний метод є допоміжним. Застосовують реакцію аглютинації (див. додаток). Сироватки хворих розводять 3% розчином натрію хлориду в співвідношенні 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600. До розведень сироватки додають спеціально виготовлений діагностикум (дифтерійна культура, змита 3% розчином натрію хлориду й вбита 0,2% розчином формаліну). Реакцію вважають позитивною при розведенні сироватки не менш 1:100. Використовується також реакція пасивної гемаглютинації з еритроцитарним бактеріальним діагностикумом (див. додаток). Діагностичним вважають титр 1:8 й вище, якщо він реєструється на другому тижні від початку хвороби.

Схема „Мікробіолоігчна діагностика дифтерії”