Мікробіологічна діагностика легіонельозу

Легіонельоз гостре респіраторне сапронозне захворювання, що найчастіше викликається видом Legionella pneumophila. Збудник входить до родини Legionellaсеае, роду Legionella й протікає у вигляді декількох клінічних форм: 1) важка вогнищева пневмонія – «хвороба легіонерів», 2) респіраторна лихоманка без ознак пневмонії – «лихоманка Понтіак», 3) лихоманка з враженням шкіри «лихоманка Форту Брег».

Матеріалом для дослідження є мокротиння, аспірат із трахеї, бронхів, біопсійний матеріал, сеча, сироватка крові. Мікробіологічну діагностику легіонельозу здійснюють експрес-методом, серологічним та бактеріологічним методом у поєднанні з інфікуванням морської свинки чи курячого ембріону.

Експрес-метод. У якості експрес методу діагностики використовують пряму РІФ зі специфічною легіонельозною сироваткою, антитіла якої мічені флюоресцеїном, а також ІФА (див. додаток) і реакцію коаглютинації. Для постановки реакції коаглютинації матеріал, який досліджують, титрують у лунках полістиролової планшетки й додають суспензію стафілококів, мічених легіонельозними імуноглобулінами. Позитивний результат проявляється утворенням аглютинату після 2-годинної інкубації.

Серологічний метод. Для виявлення в сироватці крові хворих антитіл до легіонел ставлять непряму РІФ (див. додаток) з бактеріальними діагностикумами. За 4-кратним наростанням титрів антитіл ретроспективно ставлять діагноз захворювання. З цією метою використовують також РПГА й ІФА (див. додаток).

Бактеріологічний метод.

Під час проведенні бактеріологічного методу діагностики легіонельозу матеріал для дослідження не можна поміщати в транспортні середовища. Висіви треба робити не пізніше 1 години після взяття матеріалу.

Виділення чистої культури L.pneumophila пов’язано зі значними труднощами. Це пов'язано з особливостями метаболізму і нездатністю швидкої перебудови мікроорганізму від паразитизму до використання субстратів штучного поживного середовища. Висів проводять на середовища: вугільно-дріжджевий агар (ВДА), вугільно-дріжджевий агар з антибіотиками. Рідкі живильні середовища не застосовують. Чашки інкубують не менш ніж 14 діб при 35С в атмосфері 2,5% СО_ при вологості 65%. Ріст колоній при посіві клінічного матеріалу виявляється через 4-5 діб. Максимальна кількість видимих колоній звичайно виростає на 8-10 добу. На щільних середовищах через 4-5 діб виростають дрібні (до 2 мм у діаметрі) гладенькі блискучі із сірим відтінком склоподібні колонії, що мають здатність флуоресціювати при УФ-опроміненні (жовте світіння). Ріст колоній дуже чутливий до зміни рН середовища (оптимальне рН 6,9). При мікроскопії мазків, виготовлених з колоній, які виросли, виявляють тонкі палички розміром до 2-3 мкм, схильні до поліморфізму. За Грамом фарбуються негативно. Краще фарбувати їх за Романовським та срібленням.

У разі підозри на ріст Legionella, колонії пересівають на те ж скошене середовище й на агар, що не підтримує ріст збудника – контрольне середовище. Як контрольне середовище звичайно використовують кров'яний агар без L-цистеіну чи триптичний соєвий агар. Ріст у другому пасажі на вугільно-дріжджовому агарі при відсутності росту на контрольному середовищі підтверджує діагноз. Якщо культура росте на контрольному середовищі, то це не Legionella.

Вивчають ферментативну активність, визначають антигенні властивості виділеної культури. Ферментативна активність збудника порівняно невисока. Легіонели інертні у відношенні цукрів, за винятком глюкози і багатоатомних спиртів. Утилізують крохмаль, розріджують желатину. Мають специфічні естерази до жирних кислот, фосфатазу і фосфоамідазу. Більшість видів виділяють  -лактамазу.

Ознака	L.pneumo- phila	L.bozema-nii	L.micdadеi	L.dumoffii	L.gormanii
Оксидаза	+	–	+	–	–
Каталаза	+	+	+	+	+
Уреаза	–	–	–	–	–
Розріджена желатина	+	+	+	+	+
-лакталаза	+	+	–	+	+
Утилізація крохмалю	+	+	+	+	+
Утилізація крохмалю	+	+	+	+	+
Ферментація вуглеводів з утворенням вугле- кислоти	–	–	–	–	–

За антигенною структурою всі штами підрозділяють на 7 серогруп. Визначають чутливість до антибіотиків.

Контаміновані мікрофлорою зразки, наприклад, легеневу тканину, сіють на вугільно-дріжджевий агар з антибіотиками (40 Од./мл поліміксину В),5 мкг\мл ванкоміцину, 80 мкг/мл анізаніцину). Колонії L.pneumophilla при висіві на це середовище виростають не раніше 8-ї доби. Число сторонніх колоній при цьому різко зменшується в порівнянні із висівом на середовище без антибіотика.

Аналіз води і ґрунту включає пряму РІФ і висів на вугільно-дріжджевий агар. Зразки з зовнішнього середовища попередньо інкубують з рівним об’ємом триптично-соєвого бульйону з антибіотиками при температурі 22  С на протязі 8 годин. При цьому супутня флора гине, а L.pneumophila підпадає лише під бактеріостатичну дію антибіотиків.

Найбільш чутливим методом виділення легіонел із клінічного матеріалу і з об'єктів зовнішнього середовища є інфікування морських свинок з наступним висівом суспензії тканини селезінки тварини на штучне поживне середовище чи інфікування курячих ембріонів. В організмі морської свинки відбувається селекція збудника.

Схема „Мікробіологічна діагностика легіонельозу”.