Додатки Додаток а Постановка іфа для швидкого виявлення антигенів збудника в досліджуваному матеріалі

У лунку планшету з полістиролу, що містить специфічні антитіла, адсорбовані на її поверхні, вносять досліджуваний матеріал (I) і залишають на 30 хвилин при кімнатній температурі (II).

Потім лунку промивають забуференим фізіологічним розчином (III) і вносять на 30 хвилин специфічну сироватку, антитіла якої мічені ферментом, наприклад, пероксидазою хріну (IV). Лунку знову промивають забуференим фізіологічним розчином (III) і вносять на 30 хвилин субстрат для виявлення ферменту на комплексі Аг+Аt, що утворився.

Для виявлення ферменту, який найчастіше використовується – пероксидази хріну використовують ортофенілендіамін з перекисом водню (V). Додавання субстрата призводить до того, що він піддається дії пероксидази, фіксованої на комплексі Аг+Аt. Продукти реакції, що утворюються, в лунці набувають жовтого забарвлення, інтенсивність якого може бути визначена шляхом фотометрування.

Схема постановки ІФА для швидкого виявлення антигенів збудника в досліджуваному матеріалі

Лунка полістиролового планшету

Досліджува-ний матеріал

Забуферений фізіологічний розчин

Специфічна сироватка, мічена ферментом

Субстрат

Схема механізму ІФА для швидкого виявлення антигенів збудника в досліджуваному матеріалі

+

+

=

=

Фотометрування

Додаток Б

Постановка іфа для виявлення антитіл до збудника у сироватці крові

Досліджувану сироватку (I) вносять в лунку планшета полістиролу і витримують протягом 30 хвилин при кімнатній температурі (II). У лунках таких планшетів заздалегідь адсорбовані відомі антигени. Потім лунку промивають забуференим фізіологічним розчином (III) і вносять на 30 хвилин антивидову сироватку, що містить антитіла проти глобулінів людини, мічені ферментом, наприклад, пероксидазою хріну (IV). Лунку знову промивають забуференим фізіологічним розчином (III) і вносять на 30 хвилин субстрат для виявлення ферменту на комплексі Аг+Аt. Як субстрат в лунку вносять ортофенілендіамін з перекисом водню (V).

При позитивній реакції вміст лунки набуває жовтого кольору.

Для об'єктивної оцінки результатів ІФА використовують спектрофотометр

Схема постановки ІФА для швидкого виявлення антигенів збудника в дослідному матеріалі

Досліджуваний

матеріал

Лунка полістиролового планшету

Забуферений фізіологічний розчин

Специфічна сироватка, мічена ферментом

Субстрат

Схема механізму ІФА для швидкого виявлення антигенів збудника в досліджуваному матеріалі

+

=

=

+

+

Фотометрування

Додаток В

Постановка РА на склі

На предметне скло пастерівською піпеткою наносять краплю аглютинуючої адсорбованої сироватки (I) (тобто такої, що містить тільки специфічні антитіла). Цю сироватку заздалегідь розводять фізіологічним розчином 1:25. Як контроль, поряд з сироваткою, на предметне скло наносять фізіологічний розчин (II). Добову чисту бактерійну культуру, яку досліджують(III), вносять петлею в обидві краплі й розмішують.

Облік реакції проводять через 5-10 хвилин. У разі позитивної реакції спостерігається склеювання бактерій у вигляді зерен на фоні прозорої рідини. У контролі спостерігається скаламучення рідини.

Схема постановки реакції аглютинації на склі