Мікробіологічна діагностика ботулізму

Збудник – Clostridium botulinum входить до родини Bacillaceae, роду Clostridium.

Матеріалом для мікробіологічного дослідження є блювотні маси, промивні води шлунка, кал, кров, сеча, залишки харчових продуктів. У летальному випадку досліджують вміст шлунка, кишечнику, лімфатичні вузли, головний та спинний мозок.

Використовують методи мікробіологічної діагностики: бактеріологічний, біологічний (для виявлення ботулінічного токсину в матеріалі, який досліджують).

З метою виявлення ботулінічного токсину можна використовувати також РПГА з антитільним діагностикумом (еритроцити сенсибілізовані антитоксинами відповідних типів) й визначення активності фагоцитів (ботулинічний токсин здатний пригнічувати активність фагоцитів, що відновлюється в присутності відповідної антитоксичної сироватки).

Бактеріологічний метод. Матеріал, який досліджується, розтирають у стерильній ступці з ізотонічним розчином хлориду натрію.

Висів матеріалу виконують на спеціальні поживні середовища, наприклад, середовище Кітта-Тароцці.

Одну пробу засівають у 4 пробірки, дві з який прогрівають при температурі 60°С 15 хв. (для селекції C. botulinum типу Е), іншу – при температурі80°С 20 хв. Накопичення культур клостридій типу Е и F відбувається при температуріt 28°, типу А, В, С – при 35°С протягом 48 годин.

Через 24-48 годин витримування висівів у термостаті, відзначають характер росту на середовищі Кітта-Тароцці: помутніння, газоутворення. Готують мазки, фарбують за Грамом. У разі виявленні типових клостридій з термінально розташованими спорами овальної форми у вигляді «тенісної ракетки» роблять пересівання на щільне живильне середовище (кров'яний цукровий агар) для одержання окремих колоній і виділення чистої культури.

Для ідентифікації чистої культури збудника визначають цукролітичні й протеолітичні властивості. Антигенні властивості вивчають в реакції аглютинації з типовими сироватками. Одночасно з вивченням ферментативних властивостей збудника виявляють ботулотоксин у фільтраті бульйонної культури і визначають його тип в реакції нейтралізації.

Біологічний метод. Виявлення ботулінічного токсину й визначення його типу за допомогою реакції нейтралізації має важливе значення для призначення специфічної терапії.

Для проведення реакції нейтралізації використовують сухі діагностичні антитоксичні сироватки типів А, В, С, Е, F, які розводять фізіологічним розчином до 100-200 МЕ/мл, що забезпечує нейтралізацію гомологічного токсину в пробі, яка досліджується.

Реакцію нейтралізації проводять або із сумішшю сироваток (попередня реакція), або з моновалентними сироватками для виявлення типу токсину.

Цукролітичні й протеолітичні властивості Clostridium botulinum типів а, в, с, d, е, f

Назва субстрату	Тип Clostridium botulinum
	А	В	С	D	E	F
Желатин	+	+	(+)	(+)	(+)	+
Білок	+	+	-	-	-	+
Лакмусове молоко	+	+	-	-	-	+?
Глюкоза	КГ	КГ	(К)	К	КГ	КГ
Галактоза	-	-	(КГ)	(К)	-	-
Лактоза	-	-	-	К	-	-
Левульоза	КГ	КГ	-	К	КГ	КГ
Мальтоза	КГ	КГ	(КГ)	(К)	КГ
Маніт	-	-	-	-	-
Дульцит	-	-	-	К	-	КГ
Фруктоза	КГ	КГ	(КГ)	К	КГ	(КГ)
Гліцерин	(КГ)	(КГ)	(КГ)	К	(КГ)	(КГ)
Саліцин	(КГ)	(КГ)	-	-	(КГ)	(КГ)
Декстрин	(КГ)	(КГ)	(КГ)	(К)	-	+
Сірководень	+	+	-	+	(+)

Умовні позначки:

КГ – утворюють кислоту й газ

(КГ) - кислота і газ не у всіх штамів

+ - розрідження чи кептонізація, позитивна реакція

(+) – повільна реакція чи не завжди

Підготовлений для дослідження матеріал (у вигляді фільтрату, центрифугату чи крові) розливають по 1 мл у 6 пробірок. В перші п'ять пробірок додають по 1 мл протиботулінічної сироватки типів А, В, С, Е, F відповідно, а в останню – 1 мл нормальної сироватки. Пробірки інкубують у термостаті протягом 30 хв. Через 30 хв. шістьом парам білих мишей вводять по 1 мл суміші з кожної пробірки (кров – внутрішньочеревно, інші матеріали – підшкірно) . Захворювання й смерть тварин можуть реєструватися протягом 1-4 Захворювання характеризується появою прискореного дихання, розслабленням м'язів, западанням м'язів черевної стінки («осина талія»), судомами, паралічем, смертю тварини. Миші, яким був введений центрифугат з протиботулінічною сироваткою, залишаються живими.

Якщо в матеріалі, який досліджують є ботулинічний токсин, виживає лише одна пара мишей у яких відбулася нейтралізації ботулінічного токсину антитоксичною сироваткою відповідного типу.

Визначення фагоцитарного показника. Ботулінічний токсин пригнічує фагоцитарну активність лейкоцитів. Цю властивість використовують для виявлення його в крові хворих й у харчових продуктах. Дослідження проводять у такий спосіб: кров хворого змішують у пробірці з 3% розчином цитрату натрію в співвідношенні 2:1. Дослід виконують у двох пробірках при використанні полівалентної протиботулінічної сироватки. Якщо використовують типові сироватки А, В, С, Е, F, відповідно кількість пробірок для дослідження збільшується. Після змішування взятих інгредієнтів, пробірки поміщають у термостат на 30 хвилин для нейтралізації токсину. У пробірки вносять по одному об’єму 2 млрд. суспензії Staphylococcus aureus й пробірки знову поміщають у термостат для завершення фагоцитозу на 20 хвилин. Після цього з вмісту кожної пробірки готують мазок, фіксують, фарбують азуреозином й визначають фагоцитарний показник (фагоцитарний показник – кількість стафілококів, поглинених в середньому одним лейкоцитом. Для його визначення підраховують мікроорганізми в 50 лейкоцитах й отримане число ділять на 50.

Якщо в крові хворого міститься ботулінічний токсин, фагоцитарний показник крові буде низьким, за винятком фагоцитарного показника тієї порції, в якій тип токсину відповідає типу доданої в неї сироватки, тобто відбудеться реакція нейтралізації токсину відповідними антитілами, і фагоцитарний показник буде значно вищим

РПГА з антитільним еритроцитарним діагностикумом.

Сутність реакції полягає в тому, що еритроцити сенсибілізуються специфічними антитілами, і гемаглютинація відбувається за наявності в дослідному матеріалі антигену. Її висока чутливість і специфічність дозволяє знайти в досліджуваному матеріалі мікро кількість токсинів. Діагностичний титр 1:10. Постановку РПГА (див. додаток).

Схема „Мікробіологічна діагностика ботулізму”