2. Исследование морфологических особенностей хроматина нейтрофилов (полиморфноядерных лейкоцитов)

В зрелых нейтрофилах крови обнаруживается околоядерное тельце, соединённое с сегментом ядра тонкой нитью. Эти тельца встречаются только у женщин (у мужчин в норме они отсутствуют) и получили название барабанных палочек.

Для анализа берётся мазок периферической крови и исследуется не менее 500 зрелых нейтрофилов. Определяется абсолютное число лейкоцитов с околоядерными образованиями каждого типа.

В сегментоядерных нейтрофилах наблюдается 3 основных типа этих околоядерных образований:

1) тип А, или барабанные палочки в форме круглого образования, соединённого хроматиновой нитью с сегментом ядра;

2) тип В - в форме капли или узелка, расположенного у края ядра без соединительного тяжа с ядром;

3) тип С - в форме ниточки или волосков, расположенных также у края ядерного сегмента.

Образования типа А и В встречаются в нейтрофилах крови женщин. Тип С  обнаруживается у мужчин.

Вычисляется коэффициент Q, являющийся основным критерием оценки ядерного пола нейтрофилов. Он представляет собой отношение суммы клеток, содержащих структуры типа АиВ к числу типа С: 

Q ₌ A+B

C

Показатель Q =0,65 и выше характерен для женского пола, а 0,3 и ниже  - для мужского.

Имеется прямая зависимость между частотой барабанных палочек и числом сегментов нейтрофильных ядер: снижение частоты барабанных палочек сопровождается снижением числа сегментов и наоборот. Отмечено, что степень сегментации нейтрофилов снижена по сравнению с нормой при ряде хромосомных аномалий. Например, отмечается меньшая сегментированность нейтрофилов при болезни Дауна.

3. Исследование хромосом

В отличие от исследований полового хроматина в интерфазных ядрах клеток хромосомы могут быть обнаружены только во время деления клетки. В связи с этим изучение хромосом может проводиться или в таких тканях, где постоянно спонтанно возникают митозы, или в специальных условиях культивирования, стимулирующих деление клеток. Все методы исследования хромосом человека делят на прямые и непрямые.

Прямым методом чаще всего исследуются клетки костного мозга, опухолей и эмбрионального материала

Среди непрямых методов наибольшее распространение получил метод культуры лимфоцитов периферической крови (метод Мурхеда в различных модификациях), хотя в культуру могут быть введены практически все ткани и органы человека, а также материал, взятый посмертно.

В качестве стимуляторов митотической активности клеток чаще всего используют фитогемагглютинин (белково-полисахаридный комплекс из семян фасоли), однако стимулировать митозы могут и другие препараты. Обнаружено, что лимфоциты, полученные от разных людей, при совместном культивировании стимулируют друг друга к размножению.

В зависимости от количества крови, взятой для исследования, различают обычный или макрометод (10 мл крови), полумикрометод (1 мл крови) и микрометод (0,1-0,5 мл крови). После культивирования клеток готовят цитологические препараты, которые затем окрашивают чаще всего красителем Романовского-Гимзы, дающим интенсивное гомогенное окрашивание.

Хромосомный анализ проводят в несколько этапов: визуальный анализ хромосомных препаратов; анализ хромосом с помощью зарисовки; анализ хромосом с помощью фотосъёмки и раскладки кариотипа. Данные цитогенетических исследований заносят в специальные бланки-протоколы.

Из всех 23 пар хромосом человека с помощью рутинного метода можно идентифицировать только хромосомы 1; 2; 3; 16 и У-хромосому. Остальные хромосомы трудно различимы.

С применением новых методик выяснилось, что все хромосомы имеют неоднородную линейную структуру, что выражается в разной окрашиваемости их участков по длине. Рисунок линейной дифференцированости оказался специфическим для каждой хромосомы, что и обеспечивает их идентификацию не только в нормальном сбалансированном наборе, но и при многих структурных хромосомных перестройках (рис. 11).

Рис. 11. Схематическое изображение хромосом человека при дифференциальной окраске (G-метод).

Применяя современные методы окраски (например, С-окраски) можно выявлять плотнокрасящиеся сегменты, расположенные в центромерных или околоцентромерных участках всех хромосом, а также в коротких плечах хромосом 13-15, 21-22  и в длинном плече У-хромосомы (С-диски). С помощью этого метода обнаруживается так называемый структурный гетерохроматин (неактивные районы хромосом). Выявление структурного гетерохроматина во всех хромосомах позволяет лучше оценивать хромосомный полиморфизм у человека, т. е. межиндивидуальные различия по отдельным хромосомам.

Характерной чертой гетерохроматина является его широкая количественная вариабельность. По-видимому, за исключением монозиготных близнецов, нет двух людей идентичных по возможным вариантам гетерохроматиновых блоков.

Используя G-окраску (р-р Гимза) в хромосомах можно выявить окрашенные участки, видимые по всей длине хромосом. Их обозначают как G-диски (Гимза-диски). Метод выявления G-дисков особенно широко используется для идентификации структурных перестроек хромосом человека.

Полученные препараты выявляют поперечную исчерченность, индивидуальную для каждой пары хромосом и облегчают кариотипирование. Эти новые методы выявления дифференциации по длине метафазных хромосом способствуют идентификации хромосом и отдельных хромосомных участков.

Кариотип человека определяется 46-ю хромосомами. Это число хромосом содержится в соматических клетках. Половые клетки имеют набор хромосом в 2 раза меньший - 23 хромосомы. Из 46 хромосом человека 22 пары одинаковы и у мужчин и у женщин, их называют аутосомами. Они имеют порядковый номер от 1 (самая крупная с центромерой в середине) до 22 (самая маленькая с центромерой у края). В 23-й  паре имеется чёткая половая дифференцировка: в клетках тела у женщин находятся две крупные вполне идентичные друг другу хромосомы Х,  у мужчин имеется только одна хромосома Х,  а её партнёром служит маленькая хромосома У. Хромосомы ХиУ называют половыми хромосомами.

В виду затруднений в распознавании каждой хромосомы в отдельности Patau в 1961 г. предложил групповую классификацию, согласно которой выделяются 7 групп хромосом по их величине и положению центромеры. Эти группы обозначают буквами от А до G (табл. 1).

Таблица 1.