Исследование светорассеивания.
В обычных условиях осадок комплекса Ag-At образуется медленно, ему препятствует как избыток At, так и Ag. Это затруднение удается в значительной степени преодолеть, если реакция проходит в растворе коллоида, обычно полиэтиленгликоля. Его большие молекулы, занимая значительный объем раствора, вытесняют оттуда молекулы белков, относительная концентрация которых в световом пространстве повышается, а взаимодействие ускоряется. В результате область, в которой имеется достоверная зависимость между количеством добавленного Ag и размером осадка (преципитатом), значительно расширяется и ход реакции ускоряется. Поэтому, проводя иммунохимическую реакцию в растворе полиэтиленгликоля, удается определять содержание Ag по светорассеиванию (мутности) пробы уже через несколько минут после добавления At..
Классическая теория светорассеивания, разработанная Релеем, рассматривает случай, когда размер рассеивающей части мал по сравнением с длинной волны, составляя 1/10 ее или меньше. Для фиолетового света с длинной волны 400 нм это составляет 40 нм, а для красного света с длинной волны 700 нм размер релеевской частицы не должен превышать 70 нм. Для сравнения - диаметр молекулы альбумина 8 нм, IgG - 20 нм, длина молекулы фибриногена (имеет форму нити) - около 50 нм. Интенсивность релеевского светорассеивания зависит от длины волны света и угла, под которым измеряется рассеянный свет по отношению к падающему: оно обратно пропорционально четвертой степени длины волны, когда вперед и назад попадает немного больше света, чем в бок, но диаграмма симметрична. Если же размер частицы больше 1/10 длины волны, рассеивание света остановится несимметричным, т.е. вперед по отношению к лучу падающего света его интенсивность значительно больше, чем в задней полусфере. Характер этого рассеивания также зависит от размера частиц. В ряде случаев оказывается выгодным измерять свет не под углом 900 к падающему лучу, а под меньшими углами, что значительно повышает чувствительность.
Судить о мутности раствора можно 2 способами: по количеству рассеянного света и по количеству прошедшего. Способ называется нефелометрией, а 2-ой - турбидиметрией.
Нефелометрия точнее и надежнее, т.к. фон, т.е. показание прибора, когда он заполнен прозрачным раствором, очень мал и даже небольшое количество взвешенных частиц приводят к заметному возрастанию сигнала, который в широких пределах пропорционален размеру осадка. Если же измерение проводят в турбидиметрическом варианте, то количество преципитата должно быть таким, чтобы рассеялось не менее 10-20% света, иначе измерение будет не достоверным. Кроме того, неизвестен физический закон, связывающий количество света, прошедшего через мутный раствор, и число частиц, поэтому калибровочные графики всегда сугубо эмпиричны и трудно добиться хорошей воспроизводимости. Зато турбидиметрические измерения не требуют специального прибора, измерения можно выполнять на любом фотометре или спектрофотометре.
Угловое распределение света, рассеянного частицами разного размера.
А - размер частицы меньше, чем '/10 длины волны света; Б - размер частицы больше, чем 1/10 длины волны света, но меньше длины волны света; В - размер частицы больше, чем длина волны света.
Нефелометрировать можно на специальном приборе - нефелометре или флюорометре. Различие между этими приборами состоит в том, что при нефелометрии длина волны первичного света, которым освещается раствор, и вторичного, в данном случае рассеянного, одинакова, поэтому нет необходимости во вторичном светофильтре. При флюорометрии раствор освещается светом, длина волны которого меньше, чем длина волны излучаемого света, поэтому требуется 2 светофильтра - первичный и вторичный. Если же оба они одинаковы или вторичного светофильтра вообще нет, флюорометр можно использовать как нефелометр. При нефелометрии абсолютное количество рассеянного света не имеет большого значения, т.к. чувствительность прибора обычно велика. В связи с тем, что надо измерить количество светорассеивающих частиц безотносительно их формы и размера, удобно работать в красной области спектра: длина волны больше и спектр частиц, которые ведут себя как релеевские, шире. Чувствительность метода зависит и от фона, т.е. света, рассеянного чистым растворителем. Эта величина определяется многими причинами, в том числе фокусировкой пучка света. Тут лазер дает значительные преимущества: интенсивность освещающего (и, следовательно, рассеянного) света велика; нет нагревания, как при работе с лампами накаливания; благодаря параллельности пучка удается избавиться от бликов. В лазерном нефелометре можно измерять свет, рассеянный в направлении, близком к направлению освещающего; это оправдывает себя в том случае, когда частицы большие и свет рассеивается вперед значительно больше, чем вбок и назад. Частицы иммунных комплексов как раз такие.