Плазменная фотометрия и атомная абсорциометрия

Соли металлов, попадая в пламя, способны окрашивать его, т.к. при высокой температуре пламени молекулы распадаются на ионы, электроны которых непрерывно переходят из одного квантового состояния в другое, что сопряжено с испусканием или поглощением кванта света. Некоторые элементы, например, Na+, K+, начинают интенсивно излучать свет, попадая в сравнительно низкотемпературное пламя, которое получается при сгорании метана в воздухе; другие же, например, Са++, начинают интенсивно излучать свет и поглощать его лишь при значительно более высокой температуре, которая создается при сгорании ацетилена.

Метод, в котором изучается окраска пламени, т.е. излучение, возникающее в результате перехода атома из энергетически более высокого состояния в низкое, называется пламенной фотометрией. Можно изучать и обратный процесс, т.е. измерять поглощение света при переходе атома с более низкого на более высокий энергетический уровень; этот метод называется атомной абсорбциометрией.

Иммунохимические методы

• преципитация в геле

• связывание меченых веществ

• изучение физических характеристик образующихся молекулярных комплексов

Существует огромное количество вариантов метода преципитации в геле. Но в любом случае в прозрачной желеобразной среде тем или иным способом создается либо градиент концентрации антигена при постоянной концентрации антител, либо градиенты концентраций того или другого компонента.

В том месте, где их содержание эквивалентно, выпадает осадок - образуется зона преципитации, заметная невооружённым глазом. Её форма и положение говорят о составе и концентрациях антигенов.

Связывание меченых веществ также осуществляется во многих вариантах, оно составляет основу метода конкурентного связывания, или сатурационного анализа. В этом случае образование комплекса Ag-At проводят так, чтобы в него включился весь исследуемый Ag и ещё некоторое количество меченого соединения. Затем комплекс отделяют от непрореагировавших составных частей и по количеству метки судят о содержании Ag. Третий путь основан на том, что размер молекулы комплекса значительно больше, чем размер молекулы At или Ag, поэтому и физические свойства - растворимость, способность рассеивать свет и флюоресцировать - иные. Проще всего исследовать светорассеивание (т.е. помутнение раствора ) в результате выпадения осадка. Но чтобы осадок образовывался количественно, нужны специальные условия. Оказалось, что в присутствии коллоидов свободный объём раствора, в котором могут присутствовать белковые молекулы, уменьшается, и реакция Ag-At идёт быстрее и с лучшим количественным выходом.

Методы преципитации в геле.

1. радиальная иммунодиффузия по Манчини: в этом случае прозрачный гель в чашке Петри пропитывается антителами, в нём вырезают лунку, куда помещают исследуемый раствор. Ag диффундирует из лунки в гель, где создается неравномерная концентрация - высокая по краям лунки, убывающая обратно пропорционально квадрату расстояния от её краёв. В том месте, где концентрации Ag и At эквивалентны, образуется зона преципитации в виде кольца. Чем выше концентрация Ag в лунке, тем больше радиус кольца.

2. встречная, или двойная иммунодиффузия по Оухтерлони отличается от радиальной тем, что слой геля предварительно не пропитывается антителами, а их раствор вносят в специальную лунку, находящуюся по соседству с лункой Ag. Оба вещества диффундируют навстречу друг другу, в результате чего создаются градиенты концентраций и Ag, и At. В простейшем случае зона преципитации имеет форму прямой линии, которая проходит между лунками Ag и At.

3. ракетный электрофорез, который называется также электроиммуноопределением, основан на том же принципе, что и радиальная иммунодиффузия. Но в данном варианте Ag перемещается не в результате простой диффузии, а под влиянием наложенного электрического поля.

4. классический иммуноэлектрофорез по Грабарю или Вильямсу даёт наиболее развёрнутую картину антигенного состава исследуемой жидкости. В этом случае исследуемую жидкость, например сыворотку крови, подвергают обычному электрофорезу в геле, при этом белки выстраиваются в линию соответственно своей электрофоретической подвижности. После того проводят встречную иммунодиффузию в поперечном направлении против поливалентной иммунной сыворотки, в результате чего образуется сложная система дуг преципитации.