Метод конкурентного связывания (сатурационный анализ)

Суть метода заключается в том, что некоторые вещества лиганды - способна весьма избирательно связываться с исследуемым соединением, при этом нет различия между веществом биологического происхождения (анализируемым) и его меченым аналогом, добавленным извне. Они конкурируют за лиганд в таком количестве, чтобы его связующая способность полностью насытилась (отсюда и название «сатурационный» - насыщающий анализ). Очевидно, что чем больше в пробе определяемого вещества, тем меньше связывается меченое вещество. После этого отделяют комплекс от свободных ингредиентов и подсчитывают количество метки - в одних вариантах в комплексе, в других не связанного с комплексом. Особенность метода заключается в том, что используют лиганды исключительно биологического происхождения; меченое соединение обычно получают из природного, присоединяя к нему метку в виде отдельного атома или химической группировки.

Метод имеет 2 неудобства:

1. нелинейная зависимость между результатом непосредственного измерения, т.е. количеством меченого соединения, и исследуемым параметром, т.е. содержанием определяемого вещества;

2. многоэтапность анализа.

Поэтому обычно рекомендуют каждую пробу исследовать 2 или 3 раза, отбрасывая результаты, которые находятся вне нужного диапазона. Но эти недостатки компенсируются необыкновенно высокой чувствительностью и избирательностью метода.

По своему принципу метод примыкает к классическим иммунологическим методам, основанным на РСК, но количество комплемента м.б. определено лишь полуколичественно. Кроме того, для этого метода необходимы определенным образом обработанные эритроциты (или другие заменяющие их частицы), в то время как реактивы, используемые для сатурационного анализа, значительно легче стандартизуются и более устойчивы. Но приготовление их настолько сложно, что недоступно практическим лабораториям, поэтому в условиях КДЛ метод конкурентного связывания м.б. выполнен лишь с помощью промышленно изготовленных реактивов, так называемых китов (c aнгл. KIT - набор инструментов или команда).

В химической биохимии и иммунологии метод конкурентного связывания шире всего используется для определения 3 групп веществ:

• гормонов - как белковой, так и небелковой природы;

• индивидуальных белков - как нормально присутствующих (альбумин, макроглобулин и др.) и появляющихся в условиях патологии (At к микробам и вирусам и белки инфекционных агентов);

• лекарственных соединений и вредных веществ из окружающей среды, что относится к среде фармакодинамики и токсикологии.

В качестве лигандов используются 3 группы веществ биологического происхождения: антитела, специфические транспортные белки плазмы крови, рецепторные белки органов-мишеней.

Наибольшее значение имеет использование антител, полученных путем иммунизации, в том числе и моноклональных антител, которые вырабатываются не в целом организме, а в тканевых культурах, в которых растут клетки, в больших количествах продуцирующие только нужные иммуноглобулины. Такие культуры получают путем гибридизации лимфоидных клеток иммунизированного животного со злокачественными клетками, обладающими свойствами неограниченного роста в тканевых культурах. Затем отбираются (клонируются) клетки, обладающие способностью продуцировать требуемые At и неограниченным ростом в культуре.

Транспортные белки крови обычно используется в качестве лигандов при определении стероидных гормонов, в частности, глюкокортикоидов. Недостаток их использования состоит в том, что они не очень специфичны и не позволяют дифференцировать гормоны от их непосредственных метаболитов (например: кортизол, кортизон и гидрокортизол).

Белки органов-мишеней чаще всего применяются для определения эстрогенов. В целом они обладают свойствами, аналогичными транспортным белкам крови, но их извлекают путем соответствующей обработки из органов лабораторных животных, чувствительных к эстрогенам, например, из матки крыс.

Чтобы получить меченое соединение, обычно используют чистый препарат определяемого вещества, полученный из биологического источника или синтетическим путем. Белковые вещества обычно метят 125I (иод), для этого препарат инкубируют с радиоактивным индикатором в присутствии окислителя, а затем очищают от побочных продуктов. Низкомолекулярные вещества метят тритием путем неспецифического изотопного обмена. Использование радиоактивных соединений связано с теми неудобствами, что для работы с ними необходима специально оборудованная лаборатория, поэтому все большее распространение приобретают такие варианты метода конкурентного связывания, в которых исследуемое вещество метится ферментом. Таким способом можно пометить лишь относительно крупные молекулы, т.к. образовавшаяся химическая связь не должна затрагивать функционально важные группы ни в молекуле меченого соединения, ни в ферменте.

Очень важная техническая проблема - отделение связанных с лигандом меченого и немеченого соединений от их свободных форм. Здесь используется существенное различие в молекулярной массе комплекса и свободных форм определяемого вещества. Широкое распространение при определении низкомолекулярных гормонов получило использование активированного угля, покрытого декстраном, тонкий слой которого пропускает лишь одну молекулу гормона, которая адсорбируется на угле, а высокомолекулярный комплекс остается в растворе. Такой приём получил название мгновенного диализа. Используется также метод двойных антител, когда комплекс лиганд-определяемое вещество осаждается (преципитируется) после добавления антител против белка самого лиганда.

Определение при помощи энзима, связанного с иммуносорбентом - ЭЛИЗА (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - дальнейшее развитие метода двойных антител, используемых в сатурационном анализе, но здесь отсутствует конкуренция между определяемым природным соединением и его меченым вариантом. Суть метода заключается в том, что образуется нечто вроде слоёного пирога, причём определяемое вещество составляет один из его внутренних слоёв, а индикаторный фермент - самый внешний; общий размер всей структуры зависит от количества определяемого вещества. Рассмотрим пример определения альбумина в моче: определение выполняют в лунках (гнёздах), стенки которых изготовлены из полистирена, эффективно адсорбирующего антитела. Сначала в лунки вносят первичные антитела, в данном случае кроличьи антитела против человеческого альбумина, затем после их адсорбции на стенках и отмывания избытка вносят исследуемую пробу. Содержащиеся в ней молекулы альбумина через посредство первичных антител оказываются фиксированными на стенках лунки. Затем добавляют вторичные антитела, в данном случае источником их служит сыворотка морской свинки, иммунизированной против человеческого альбумина; они фиксируются на тех же альбуминовых молекулах, которые другими группами адсорбированы на первичных антителах. Четвертый слой иммунного «пирога» - фермент пероксидаза, фиксированная на кроличьих антителах против иммуноглобулинов морской свинки; они связываются со вторичными антителами, при этом количество фиксированной пероксидазы оказывается пропорциональным содержанию альбумина в исследуемой пробе. После добавления каждого реагента и завершения реакции связывания избыток непрореагировавших белков тщательно удаляют отмыванием буферным раствором, кроме того, добавляют инактивированные сыворотки для подавления неспецифических реакций. После окончания всех адсорбций и отмываний проводят ферментативную реакцию с о-фенилендиамином и перекисью водорода. Благодаря присутствующей пероксидазе о-фенилендиамин окисляется, и через некоторое время интенсивность окраски измеряется фотометрией. Метод очень чувствителен и высокоспецифичен; в отличие от радиоиммунных методов он не требует специфичных условий.

Комплекс, образующийся при одном из вариантов определения сывороточного альбумина с помощью связанного с иммуносорбентом энзима (схема).

АЛБ - сывороточный альбумин человека (опреде­ляемое вещество); римскими цифрами обозначены компоненты аналитической системы: I — полистиреновая стенка лунки микротитратора; II — первич­ные антитела (из сыворотки кролика, иммунизиро­ванного против сывороточного альбумина человека) ; III — вторичные антитела (из сыворотки морской свинки, иммунизированной против сывороточного альбумина человека); IV—-пероксидаза из хрена, фиксированная на кроличьих антителах против иммуноглобулинов морской свинки.