Фотометрия.

Биохимические аналитические методы чаще всего оканчиваются цветными реакциями, в результате которых прозрачный раствор приобретает окраску, т.е. способность избирательно поглощать свет с определенной длиной волны. Разумеется, что тот свет, который не поглотился, проходит через раствор, поэтому субъективно воспринимаемая окраска является дополнительным цветом относительно того, который поглотился. Так, если интенсивно поглощается красный цвет, то раствор бывает зеленым или синим, если поглощается фиолетовый, то раствор желтый и т.д. График, изображающий поглощение света с разными длинами волн, называется спектральной кривой. Обычно для фотометрии используется область, где поглощение света наибольшее, т.е. максимум спектральной кривой. Для аналитических целей пригодны только те цветные реакции, в которых развивается окраска, пропорциональная концентрации исследуемого вещества. В этом случае посредством фотометрии измеряется количество поглощаемого света и по этим данным рассчитывается искомая концентрация. Но качественные результаты удается получать лишь в определенном диапазоне концентраций, в котором соблюдаются закон поглощения света Ламберта-Бера, который показывает логарифмическую зависимость между концентрацией окрашенного вещества в растворе, толщиной раствора и долей света, которая в этом растворе поглощается.

Фотометрические приборы бывают 2 видов: фотометры и спектрофотометры. В фотометрах нужные спектральные диапазоны выделяются при помощи светофильтров, поэтому число участков спектра, в котором может проводиться измерение, равно числу светофильтров. В спектрофотометре участки спектра выделяются при помощи призм или дифракционных решеток, поэтому можно установить любую длину волны в заданном диапазоне. Чаще всего в клинической биохимии фотометрия проводится в области 400-700 нм ( видимая область спектра), >700 нм - ближняя инфракрасная область, <400 нм - ультрафиолетовый диапазон, 300-400 нм - ближняя область ультрафиолета, 220-300 нм - коротковолновой диапазон.

Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрасной области пригодны кюветы из обычного стекла; для ближней ультрафиолетовой области нужны кюветы из специального стекла - увиолевые; в коротковолновой области пригодны только кюветы из кварца и сапфира.

Последовательность операций при работе на фотометрах и спектрофотометрах различных конструкций несколько различается, но принцип остается один: сначала устанавливают длину волны, выбирая светофильтр на фотометре или вращая соответствующую рукоятку на спектрофотометре. Далее - установка нуля, для этого в кюветодержателе устанавливают кювету, заполненную растворителем или раствором, полученным в результате холостого опыта; изменяя ширину щели, добиваются того, чтобы показания прибора соответствовали величине, предусмотренной инструкцией (обычно это нуль), после чего холостую пробу заменяют опытной и производят отсчет величины оптической плотности.

Флюорометрия

Эффект флюоресценции заключается в том, что исследуемый объект светится под влиянием облучения светом с более короткой длиной волны. Аналитические методы, использующие флюоресценцию, основаны на предположении, что при освещении светом одинаковой интенсивности сила света флюоресценции пропорциональна содержанию исследуемого вещества. Но такая пропорциональность имеется только в относительно узком диапазоне концентраций, из которых на практике очень легко выйти, поэтому при налаживании флюорометрических исследований надо очень тщательно проверять линейность калибровочного графика во всем диапазоне возможных величин. Нарушение линейности связано с явлением гашения флюоресценции, которое обусловлено тем, что по мере углубления пучка возбуждающего света в раствор интенсивность его уменьшается вследствие поглощения. Чем концентрированнее раствор, тем поглощение это больше, поэтому сила возбуждающего света оказывается также уменьшенной. Отсюда общее правило, что флюорометрии должны подвергаться относительно разбавленные растворы.

Физический эффект флюоресценции заключается в том, что молекула исследуемого вещества поглощает квант света возбуждения и при этом переходит в новое, энергетически более богатое состояние; через некоторый промежуток времени она излучает избыточную энергию в виде кванта света флюоресценции. В связи с тем, что энергия кванта света обратно пропорциональна длине волны, длина волны возбуждающего света всегда короче излучаемого. Промежуток времени между поглощением света и его излучением очень мал, и в обычных флуоресцентных методах на него не обращают внимания, но он достаточен, чтобы на молекулярном уровне успели произойти некоторые события, в частности, чтобы молекула могла изменить свое положение в пространстве. На этом основан метод молекулярной вискозиметрии путем изменения поляризации света флюоресценции.