23.2.8. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ)

Газорідинна хроматографія (ГРХ), незважаючи на її широкі можливості, не може застосовуватись для розділення і визначення речовин з високою молекулярною масою (більше 300), нелетких, термічно

хроматографії високого тиску оснований на тих же принципах, що і ГРХ, тільки замість газу-носія застосовують потік рідини, як рухому фазу, що не змішується з рідкою нерухомою фазою хроматографічної колонки.

хроматографічної колонки може бути кімнатною, що дозволяє хроматографу вати білки, амінокислоти, вуглеводи і інші нестійкі сполуки. Мо-

компонентів з використанням ВЕРХ може бути основане на таких принципах: адсорбція, розподілення, іонний обмін, ексклюзія.

Колонки в ВЕРХ заповнюють твердими пористими частинками розміром 5 – 10 мкм (силікагель, алюмогель, полімерні сорбенти і ін.), поверхня яких вкрита тонкою плівкою рідкої речовини(нерухома фаза) під великим тиском. Малі розміри часток сорбенту і заповнення ними колонки під тиском робить простір між ними дуже малим. Це підвищує

-швидкість проведення аналізу перевищує більшість інших існуючих методів;

-колонки з сорбентом для ВЕРХ багаторазового використання і не потребують відновлення чи регенерації;

-відтворюваність результатів різних проб дуже висока;

-управління дослідом, аналізом, обробкою інформації, та оформлення кінцевих результатів повністю автоматизовані;

-робоча температура термостатування лежить між температу-

рою замерзання і кипіння рухомої фази(частіше в межах 20 – 50 °С);

281

Рис. 23.11.6.2. Схема пристрою для

ВЕРХ

ВЕРХ дуже широко застосовується для розділення і визначення самих різноманітних речовин: оптично-активних сполук, білків, нуклеїнових і амінокислот, полісахаридів, барвників, вибухових речовин, біологічних об’єктів, лікарських препаратів і т.д. Метод використовують для проведення профільного хроматографічного аналізу медичнобіологічних об’єктів у випадку їх патологічних відхилень від норми.

23.11.6. Афінна хроматографія

Афінна (споріднена) хроматографія розглядається як окремий принцип розділення в рідинній хроматографії і використовується для специфічного виділення окремих речовин, переважно білків.

Суть методу полягає у тому, що до поверхні сорбенту(S) прикріплюють (імобілізують) певну речовину (І) – антитіло, яка високоспецифічно здатна зв'язувати якийсь клас речовин– антиген (фермент, імуноглобулін, рецептор, гормон та ін). Таким імобілізованим сорбентом (S-І) заповнюють колонку і пропускають суміш речовин, яка

282

містить речовину, необхідну для виділення (Р). Ця речовина обов'язково зв'яжеться з сорбентом«афінним» шляхом, найчастіше ковалентним зв'язком (S-І-Р). Усі інші компоненти суміші пройдуть вниз по колонці без будь-якого зв'язування. Після ретельної промивки колонки інертним розчином, проводять відмивання речовини, яка зв'язалась афінно. Цього досягають шляхом елюювання розчином, який викликає дисоціацію комплексу (S-І) + (Р).

Виділення речовин цим методом буде залежати від природи іммобілізованої речовини (І), яка у кожному конкретному випадку різна і служить для дуже вузької але специфічної ролі.

23.11.7. Іонообмінна хроматографія

сорбентом десорбується певна кількість іонів, а з розчину поглинається така ж кількість інших іонів того ж знаку у суворо еквівалентному

NH3+OH- і ін.). Неорганічні сорбенти одержують, прививаючи до матриці (наприклад, силікагелю), різні іоногенні чи комплексоутворюючі групи. Запропоновано значне число різних іонообмінних смол для використання в ролі іонообмінників. Деякі з них приведені в табл. 23.11.7.1.

283

катіоніт в Н+-формі

Врозглянутій схемі катіоніт в Н-формі складається з матриці R—

ііоногенної групи SO3-H+. Від’ємно заряджена група SO3- міцно зв’язана ковалентним зв’язком з матрицею, і в іонообмінному процесі участі не

бере. Протиіон H+ може легко відщеплятися і обмінюватися на катіон

*КУ – катіоніт універсальний; СДВ – стиролдивінілбензен; КФ – катіоніт фосфоновокислий; КБ – катіоніт буферний; АВ – аніоніт високоосновний; АН – аніоніт низькоосновний

Спорідненість іонів до сорбенту залежить від ряду факторів: заряду іона, його радіусу, радіусу гідратної (сольватної) оболонки, температури і ін.

Для катіонітів в основному характерна наступна послідовність здатності сорбуватися:

284