Заняття 3 Тема: Кількісне визначення білків за допомогою біуретового реактиву теоретична частина:
Клініко-біохімічний аналіз за звичаєм починається з визначення вмісту загального білка в плазмі (сироватці) крові. Потреба встановлення його концентрації обумовлена тією різноманітною і важливою фізіологічною роллю, яку відіграють білки плазми в організмі. Завдяки їм підтримується в'язкість, плинність крові, формується її об'єм у судинному руслі, а формені елементи утримуються у зваженому стані. Білки плазми здійснюють транспорт численних екзо- і ендогенних речовин, беручи участь у зв'язуванні гормонів (кортизон), мінеральних компонентів (кальцій, мідь, залізо), ліпідів, пігментів та ін. Будучи амфотерним поліелектролітом, вони грають важливу роль у регуляції кислотно-лужного стану організму, являються факторами згортання крові, антитілами. Тому зміна їх вмісту в крові призводить до порушення гомеостазу та специфічної реактивності організму.
Відомі способи визначення концентрації загального білка в сироватці крові можна поділити на:
азотометричні: класичний метод К’єльдаля та його модифікація;
гравіметричні;
спектрофотометричні, які полягають у вимірюванні ступеню світло поглинання в ультрафіолетовій області (200-220 чи 280 нм);
колориметричні, які ґрунтуються на кольорових реакціях білків з певними реактивами;
флюорометричні;
поляриметричні та ін.
Практична частина
Завдання для домашнього (письмового) виконання:
Етапи виділення білка з біологічного об’єкту.
Методи визначення структури білків, дослідження їх властивостей, виділення та очистки індивідуальних амінокислот та білків.
Суміш гліцину, аланіну, глутамінової кислоти, лізину, гістидину та серину розділили методом електрофорезу на папері за рН=6,0. Які амінокислоти пересувались до аноду, які до катоду і які залишились на старті?
Мета заняття: вивчити основні методи виділення, очистки, розділення білків, основні методики кількісного визначення білків. Для виконання роботи необхідно вивчити такі питання теорії:
Запитання до обговорення:
Методи виділення білків.
Методи очистки білків.
Методи розділення білків та амінокислот.
Методи кількісного визначення білків.
Принципи кількісного визначення концентрації білка біуретовим методом; за білковим азотом.
Принцип визначення білка: а) спектрофотометричний; б) метод Лоурі; в) метод Бредфорда.
Хід роботи
Практичне значення роботи: Кількісні методи визначення білків використовуються при встановленні, наприклад, діагнозу багатьох захворювань шляхом проведення визначення концентрації білків у біологічних рідинах. Підвищення рівня концентрації білка до 120 г/л (гіперпротеїнемія) зустрічається рідко (наприклад, при деяких хронічних запальних процесах внаслідок утворення антитіл − поліартрит, ревматизм; при згущенні крові через значні втрати рідини). Зниження кількості білка (гіпопротеїнемія) спостерігається при недостатньому надходженні білків з їжею, при порушенні процесів біосинтезу білків в органах, при ураженні печінки.
Матеріали і реактиви. Робочий розчин біуретового реактиву, стандартний розчин альбуміну (1 мл стандартного розчину містить 0,1 г білка), фотоелектроколориметр, пробірки, піпетки, кювети з товщиною прошарку 1 см, міліметровий папір.
Принцип методу. Білки (поліпептиди) у лужному розчині в присутні сульфату міді (ІІ) утворюють комплексні сполуки міді, пофарбовані в синьо-фіолетовий колір, інтенсивність якого залежить від кількості пептидних зв'язків у молекулі білка. Продукти неповного гідролізу білка (пептиду) дають червоне або рожеве фарбування в біуретовій реакції. Спочатку пептидні групи поліпептиду зазнають у лужному середовищі єнолізацію:
Єнольна форма поліпептиду взаємодіє з гідроксидом міді (ІІ) й утворює пофарбований у синьо-фіолетовий колір комплекс:
Хід роботи. До 5 мл робочого розчину біуретового реактиву додають, уникаючи утворення піни, 0,1 мл сироватки крові. Через 30 хв., саме пізніше через годину, пробу колориметрують на ФЕК в кюветі із шириною прошарку 10 мм при зеленому світлофільтрі (із максимумом пропускання 540 − 560 нм, краще 546 нм). Показники екстинції враховують у порівнянні з такими контрольної проби, що готують шляхом доливання до 5 мл робочого розчину біуретового реактиву 0,1 мл розчину хлориду натрію. Розрахунки ведуть за калібрувальною кривою.
Для побудови каліброваного графіка в п'ять хімічних пробірок поміщають відповідно 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мл розчину альбуміну, що містить 10 мг білка в 1 мл. Загальний об’єм у кожній пробірці доводять до 1 мл дистильованою водою і потім додають по 5 мл біуретового реактиву. Вміст пробірок перемішують і лишають на 30 хвилин, потім знімають показники екстинції. Після виміру отримані дані відкладають: на осі ординат величину оптичної щільності, а по осі абсцис − кількість білку, що відповідає цій величині. Потім визначають кількість білка в сироватці крові, також як і при одержанні каліброваної кривої. Концентрацію білка розраховують на 1 мл не розведеної сироватки.
В кінці роботи зробити висновок.