ПРактична частина:

 Запитання для домашнього (письмового) виконання:

1. Поясніть терміни, які характеризують властивості ферментів: а) термолабільність, б) температурний оптимум дії, в) рН оптимум дії, г) алостеричний активатор, д) неконкурентний інгібітор, е) конкурентний інгібітор, ж) просторова специфічність, з) абсолютна специфічність, и) регуляція за принципом зворотного зв’язку.

2. Покажіть залежність швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату при постійній концентрації ферменту (графік). Яка одиниця активності ферментів.

3. Написати рівняння реакцій до кожного класу і підкласу ферментів.

Мета заняття: на прикладі окремих ферментів вивчити їх загальні властивості. Для виконання роботи необхідно вивчити такі питання теорії:

 Запитання до обговорення:

1. Загальні уявлення про каталіз. Які речовини називаються ферментами?

2. Хімічна природа ферментів. Уявлення про механізм дії ферментів.

3. Активний центр ферменту. Що таке кофермент? Апофермент і його роль.

4. Чинники, що впливають на швидкість ферментативної реакції.

5. Активатори та інгібітори ферментів.

6. Механізм регуляції активності ферментів.

7. Що таке ізофермент?

8. Класифікація ферментів.

Хід роботи

Практичне значення роботи: Вивчення властивостей ферментів необхідно для підбору оптимальних умов дії ферментів або визначенні їх активності в наукових або клінічних дослідженнях, а також для проведення фармакологічного аналізу ферментативних препаратів. Неправильно підібрані стандартні умови призводять до помилок при діагностиці захворювань.

Матеріали і реактиви. Розчин слини, 1 %-ний розчин крохмалю, реактив Люголя (розчин І₂ у КІ), дистильована вода, 0,4 %-ний розчин гідроксиду натрію, 0,4 %-ний розчин соляної кислоти, 0,2 %-ний розчин соляної кислоти, екстракт дріжджів, 1 %-ний розчин сахарози, реактив Фелінга, 1%-ний розчин NaCl, 1%-ний розчин CuSO₄; пробірки, водяна лазня або термостат, штатив для пробірок, пальник, фільтри, фільтрувальна лійка.

Дослід 1. Виявлення в слині ферменту амілази і її термолабільність.

Принцип методу. Про активність ферменту судять за його дією на субстрат (зникнення субстрату або поява продуктів його розщеплення). Про вплив температури на активність амілази слини судять за розщепленням цим ферментом крохмалю при різноманітних температурних умовах. Ступінь розщеплення крохмалю визначають за йодною пробою.

Хід роботи. У пробірку вносять 2-3 мл слини. З неї відбирають 4 краплі слини й додають 16 крапель води. Слину, що залишилася, кип'ятять 5 хвилин, охолоджують. Беруть 3 пробірки, наливають по 10 крапель 1% розчину крохмалю. У першу пробірку додають 10 крапель розведеної слини, у другу – 10 крапель прокип'яченої слини, у третю – 10 крапель води в якості контролю. Всі пробірки ставлять у термостат на 10 хвилин при 38 ⁰С. Потім з умістом пробірок проводять якісні реакції на крохмаль.

Реакція на крохмаль (йодна проба):

В усі 3 пробірки наливають по 1 краплі розчину йоду в йодиді калію. При наявності крохмалю з'являється синій колір.

Результати занести в таблицю:

№ з/п	Фермент	Субстрат	Температура	Йодна проба
1	2	3	4	5

Зробити висновок, щодо термолабільності амілази.

Дослід 2. Вплив рН середовища на активність амілази.

Принцип методу. Про вплив рН на активність амілази судять за зміною інтенсивності забарвлення розчину крохмалю з йодом. Для амілази слини оптимум рН = 6,8, а в кислому і лужному середовищі активність амілази знижується.

Хід роботи. У пробірку вносять по 0,5 – 1,0 мл слини, у першу додають 1,0 мл розчину 0,4 %-ного розчину NаОН, у другу – 1,0 мл 0,4 %-ного розчину НСl. В обидві пробірки додають по 3 – 4 краплі розчину крохмалю і ставлять у водяну баню або термостат при 37 ⁰С на 15 – 20 хвилин. У зв’язку з тим, що NаОН реагує з I₂ (NaOH + I₂ → 2NaІ +2H₂O) перед додаванням реактиву Люголя в пробірку з NаОН вносять 0,2 %-ний розчин НСl.

Дослід 3. Специфічність дії ферментів.

Принцип методу. Про активність ферменту судять за його дією на субстрат (зникнення субстрату або поява продуктів його розпаду). Амілаза розщеплює полісахариди і не діє на дисахариди (мальтозу або сахарозу). Сахараза розщеплює тільки сахарозу на глюкозу і фруктозу і не діє на крохмаль та інші дисахариди.

а) Дія амілази на крохмаль і сахарозу.

Хід роботи. У 2 пробірки вносять по 0,5 – 1 мл слини. У першу додають 1 мл крохмалю і поміщають у термостат на 15 – 20 хвилин, потім до суміші додають 3 – 4 краплі реактиву Люголя і переконуються в наявності гідролізу крохмалю. До вмісту другої пробірки додають 1 мл сахарози і поміщають у термостат на 15 – 20 хвилин. Потім додають реактив Фелінга, переконуються в наявності гідролізу сахарози на глюкозу і фруктозу за червоним забарвленням.

б) Дія сахарази на крохмаль і сахарозу.

Хід роботи. У дві пробірки вносять по 0,5 – 1 мл екстракту дріжджів. У першу додають 3 – 5 мл 1 %-ного розчину крохмалю, у другу – 3 – 5 мл 1 %-ного розчину сахарози, добре перемішують і ставлять у термостат при температурі 37 ⁰С на 15 – 20 хвилин.

Після цього в першу пробірку додають 3 – 4 краплі реактиву Люголя і переконуються у відсутності гідролізу крохмалю; з умістом другої пробірки проводять реакцію Фелінга і переконуються в наявності гідролізу сахарози.

Результати дослідів 2, 3 заносять у таблицю такої форми:

№ з/п	№ пробірки	Фермент	Субстрат	Умови досліду	Результати реакцій
Дослід 2	1	амілаза	крохмаль
	2	амілаза	крохмаль
Дослід 3а	1	амілаза	крохмаль
	2	амілаза	сахароза
Дослід 3б	1	сахараза	крохмаль
	2	сахараза	сахароза

Дослід 4. Вплив активаторів і інгібіторів на активність амілази.

Принцип методу. Активатором амілази є NaCl, а інгібітором – CuSO₄. Про вплив цих речовин на активність амілази судять за ступенем гідролізу крохмалю під впливом ферменту при NaCl і CuSO₄.

Хід роботи. До 1 мл слини додати 5 мл дистильованої води. Взяти 3 пробірки. У першу наливають 1 мл дистильованої води, у другу – 2 краплі розчину NaCl, у третю – 2 краплі розчину CuSO₄. В усі пробірки внести 1 мл розчину слини, перемішати і додати по 5 крапель розчину крохмалю, знову перемішати і поставити в термостат при 38 ⁰С. Через 10 хвилин додати по 1 краплі розчину йоду.

Результати роботи заносять у таблицю, роблять висновки.

	Пробірки
	1	2	3
Вміст пробірок
Забарвлення після додавання йоду
Висновки

В кінці роботи зробити висновок.