Хід роботи

Мета роботи: засвоїти метод визначення концентрації холестерину в сироватці крові.

Практичне значення роботи: За визначенням концентрації холестерину в сироватці крові судять про ліпідний обмін. При порушенні ліпідного обміну холестерин може накопичуватися в крові.

Збільшення вмісту холестерину спостерігається при атеросклерозі, цукровому діабеті, вроджених порушеннях обміну, захворюваннях печінки.

Принцип методу: Холестерин в присутності карбонового ангідриду та суміші оцтової та сірчаної кислот утворює речовину зеленого кольору. Інтенсивність забарвлення дослідного розчину прямо пропорційна концентрації холестерину.

Реактиви:

1. Реагент на холестерин (карбоновий ангідрид – 75-85%, оцтова кислота – 15-25%);

2. Калібрувальний розчин холестерину (4,665±0,2328) ммоль/л;

3. Сульфатна кислота концентрована;

4. Дистильована вода;

5. Фізіологічний розчин (0,9%-ний розчин NaCl).

Аналізуємий матеріал: сироватка крові.

Приготування робочих розчинів.

1. Робочий розчин. Вміст флакона з реактивом на холестерин перенести до термостійкої колби місткістю 200 мл та поступово додати, при охолодженні холодною водою і перемішуванні, 9 мл сульфатної кислоти з флакона. Отриманий реактив повинен бути безбарвним або блідо-жовтим. Зберігається на протязі одного тижня у холодильнику в склянці із темного скла з добре притертою скляною пробкою. Якщо реактив набуде жовтого кольору, то він не придатний до використання.

2. Калібрувальний розчин холестерину – придатний до використання.

Після розкриття ампули реактив бережуть у холодильнику в посуді з добре притертою скляною або пластмасовою пробкою. При збереженні в герметичній ємності розчин стійкий. Концентрація холестерину в розчині (4,665±0,2328) ммоль/л ((1,8±0,09) мг/мл).

Хід роботи:

Складаємо робочу схему проведення досліду.

Аналіз проводять у відповідності зі схемою, наведеною в таблиці.

Розрахунок концентрації холестерину здійснюють за формулою:

С = 4,665 ∙ Е досл. пр. / Е кал. пр.

де: С – концентрація холестерину у дослідній пробі, ммоль;

4,665 – концентрація холестерину у калібрувальній пробі, ммоль/л;

Е досл. пр. − оптична щільність дослідної проби, од. опт. щільності;

Е кал. пр. – оптична щільність калібрувальної проби, од. опт. щільності.

Контроль якості: достовірність одержуваних результатів контролюють за допомогою атестованих контрольних сироваток “Ліонорм” (Чехія) або “Біоконт С”.

Нормальна концентрація холестерину у сироватці крові – 1,7 – 8,3 ммоль/л, (10 – 50) мг/дкл.

Таблиця

Відміряти у пробірку, мл	Робочий розчин	Аналізуємий розчин	Фізіологічний розчин	Калібрува-льний розчин холестерину	Показники оптичної щільності
					Екал. пр.	Едосл. пр.
Холоста проба (контроль)	4,30	–	0,1	–	−	−
Калібрувальна проба	4,30	–	–	0,1		−
Дослідна проба 1.	4,30	0,1	–	–	−
2.	4,30	0,1	–	–	−
3. і т.д.	4,30	0,1	–	–	−
10.	4,30	0,1	–	–	−
До робочого розчину повільно, по стінці пробірки, додають не гемолізовану сироватку або калібрувальний розчин. Пробірку струшують 10-12 разів та витримують у термостаті при +37 0С протягом 20 хв. Вимірюють оптичну щільність дослідної проби (Е досл. пр.) проти холостої проби (контроль). Забарвлення стійке протягом 20 хв.

В кінці роботи зробити висновок.