Виявлення пероксидази за реакцією з йодисто - калі­євим крохмалем

Суть методу. Метод грунтується на розщепленні пероксиду водню ферментом пероксидазою з виділенням атомарного кисню, який, окислюючи йодистий калій, звільняє йод, що утворює з крохмалем сполуку синього кольору.

Матеріальне забезпечення: Ваги лабораторні аналітичні і технічні; пробірки скляні на 20 мл; піпетки на 2 і 5 мл; піпетки на 5 і 10 мл з ціною поділки 0,1 мл; крапельниці з темного скла; колби мірні на 250 і 500 мл; колби конічні на 250 мл; баня водяна; 0,5%-ний розчин пероксиду водню; крохмаль картопляний; калій йодистий х.ч. або ч.д.а.; дистильована вода; лійки скляні В 56—80 ХУ-1; фільтри паперові діаметром 11 см.

Для приготування йодисто-калієвого крохмалю зважують 3 + 0,01 г крохмалю і змішують з 5—10мл дистильованої хо­лодної води до одержання однорідної маси. Окремо у колбі до­водять до кипіння 100 мл дистильованої води і, при безперер­вному помішуванні, доливають воду до розведеного крохмалю, не допускаючи утворення грудочок. Одержаний розчин до­водять до кипіння. Після охолодження до розчину крохмалю додають З г йодистого калію, перемішуючи до повного розчи­нення кристалів.

Розчин йодисто-калієвого крохмалю нестійкий, тому його слід готувати у невеликих кількостях і зберігати в темному про­холодному місці не більше 2 днів. Допускається замість йодис­то-калієвого крохмалю використовувати окремо приготовлені 1%-ний розчин крохмалю і 10%-ний розчин калію йодистого.

При використанні йодисто-калієвого крохмалю, який збе­рігався більше 2 днів, необхідно його перевірити. Для цього у пробірці необхідно закип'ятити 5 мл молока і після охолод­ження додати 5 крапель йодисто-калієвого крохмалю і 5 кра­пель 0,5%-ного розчину перекису водню і перемішати. Поява темно-синього або сірувато-синього забарвлення свідчить про непридатність розчину.

Хід визначення

В скляну пробірку відміряють 5 мл молока і додають 5 крапель розчину йодисто-калієвого крохмалю і 5 крапель 0,5%-ного розчину пероксиду вод­ню, перемішуючи колоподібними рухами вміст пробір­ки після внесення кожного реактиву.

Якщо використовують окремо розчини крохмалю і йодистого-калію, то у кожну пробірку з молоком додають 0,5 мл 1%-ного розчину крохмалю, 2 краплі 10%-ного розчину калію йодистого і 5 крапель 0,5%-ного розчину пероксиду водню, перемішуючи вміст пробірок після внесення кожного реактиву.

Наявність пероксидази визначають за зміною забар­влення. При відсутності ферменту в молоці його колір не змінюється. Це свідчить, що молоко пастеризували з дотриманням температурного режиму. При наявнос­ті пероксидази в молоці вміст пробірок не більш як че­рез 2 хв набуває сіро-синього забарвлення, яке посту­пово переходить у темно-синє. Отже, молоко не підда­валося пастеризації або піддавалося пастеризації при температурі нижче 80°С, чи було змішане з непастеризованим. Поява забарвлення в пробірках через 2 хв після внесення йодисто-калієвого крохмалю і пероксиду водню не свідчить про відсутність пастери­зації. Чутливість методу дає змогу виявити додавання не менше 5% непастеризованого молока до пастеризо­ваного.