1. Цветные реакции на аминокислоты, пептиды, белки:

а) Биуретовая реакция

В пробирку внесите 5 капель исследуемого раствора (1 % раствор белка), добавьте 10 капель 10 % раствора NаОН и 1 каплю 1 % раствора сульфата меди. В присутствии пептидов, имеющих 2 и более амидные связи, появляется красно-фиолетовое окрашивание.

Реакция обусловлена образованием стабильного биуретового комплекса за счёт координационных связей.

б) Нингидриновая реакция

В пробирку внесите 5 капель исследуемого раствора (1 % р-р белка), добавьте 3 капли 0,5 % раствора нингидрина, нагрейте до кипения. Через 2-3 мин смесь окрашивается в розовый, затем красный или красно-фиолетовый цвет за счёт взаимодействия нингидрина с α-аминокислотами.

Это объясняется распадом аминокислот на соответствующие альдегиды, диоксид углерода и аммиак. Две молекулы нингидрина (восстановленная и окисленная) конденсируясь с аммиаком, образуют краситель.

в) Реакция Фоля

С помощью этой реакции доказывается наличие серосодержащих аминокислот. В пробирку внесите 5 капель исследуемой жидкости, добавьте 5 капель 3 % раствора NаОН и 1 каплю 5 % раствора ацетата свинца. Смесь нагрейте, при интенсивном кипячении жидкость темнеет за счёт образования сульфида свинца.

Это обусловлено разрушением цистеина, цистина и метионина при нагревании со щелочью и образованием сернистого натрия (Nа₂SO₃). При взаимодействии уксуснокислого свинца со щёлочью образуется плюмбит натрия, который с Nа₂SO₃ даёт чёрный осадок.

2. Необратимые реакции осаждения белков (денатурация):

а) Осаждение белков при нагревании

В три пробирки налейте по 2 мл раствора белка. Нагрейте содержимое 1-ой пробирки. Образуется осадок протеинов вследствие их тепловой денатурации. Во вторую пробирку добавьте 1 каплю 10% раствора уксусной кислоты и тоже нагрейте. Осадок выпадает скорее и полнее, т.к. протеины в слабокислой среде находятся в изоэлектрическом состоянии и легче агрегируются. В третью пробирку прилейте 0,5 мл 10% раствора уксусной кислоты и нагрейте. Осадка не образуется даже при кипячении, т.к. происходит изменение заряда на противоположный знак. А частицы, имеющие одноимённые заряд, не способны к склеиванию.

б) Осаждение белков минеральными кислотами

В три пробирки налейте по 1 мл концентрированных кислот – соляной, серной, азотной. Осторожно наслоите во все сосуды по 1 мл сыворотки. На границе двух жидкостей появляется белое кольцо, т.к. в белке под действием минеральных кислот происходит изменение рН среды (изоэлектрическая точка). Реакция с азотной кислотой называется пробой Геллера (см. ниже) и применяется в клинике для доказательства белка в моче.

в) Осаждение белков органическими растворителями

В две пробирки налейте по 1 мл сыворотки и добавьте в первую – несколько капель 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), а во вторую – немного сульфосалициловой кислоты. Наблюдается выпадение осадка. Органические вещества способны взаимодействовать с функциональными группами протеинов, что приводит к разрыву дополнительных связей, стабилизирующих вторичную и третичную структуры нативных белков, и образованию новых.

г) Осаждение белков солями тяжёлых металлов

В три пробирки налейте по 1 мл раствора белка. Прибавьте в первую 2-3 капли 5% раствора уксуснокислого свинца (Pb(CH₃COO)₂), во вторую - 3-4 капли 1н. раствора сернокислой меди, в третью - 2-3 капли 3% раствора хлорного железа. Затем содержимое пробирок взболтайте и добавьте в каждую по 3-4 мл воды. Докажите, что во всех случаях осадок в воде нерастворим. Соли тяжёлых металлов (меди, ртути, серебра, свинца и т.д.) образуют прочные связи с функциональными группами белков (чаще всего с – SН), изменяя их конформацию.

д) Осаждение белков алкалоидными реактивами

В две пробирки налейте по 2 мл сыворотки, в одну добавьте несколько капель 0,5 н. соляной кислоты, а затем по каплям 3% раствор жёлтой кровяной соли до образования осадка белка. Во вторую пробирку внесите 2-3 капли танина. Образуется осадок, не растворяющийся в воде. Происходит агрегация молекул.

Сравните полноту осаждения белков разными реагентами.