БХ / Метод 2008 / Занятие АО 1

Лабораторно-практическое занятие №18

Тема: Биологическая ценность пищевых белков, процессы переваривания белков и всасывание аминокислот. Общие пути обмена аминокислот (реакции декарбоксилирования, дезаминирования, трансаминирования).

Цель: Изучить процессы переваривания белков в желудочно-кишечном тракте, выработать представления об общих путях превращения аминокислот в организме.

Значение: Белки – важнейшие пластические компоненты диеты, незаменимые источники биогенного азота, необходимые для роста и регенерации. В то же время белки – носители чужеродной антигенной информации и должны гидролизоваться при переваривании, утрачивая антигенность, иначе их неполное расщепление приведет к пищевой аллергии, либо аутоаллергическим эксцессам. Аминокислоты, образующиеся при переваривании белков и поступающие в клетки тканей, подвергаются катаболизму, а так же специфическим реакциям. Катабализм большенства аминокислот начинается с отщепления ά-аминогруппы в результате двух типов реакций: трансаминирования и дезаминирования. Некоторые аминокислоты могут подвергаться декарбоксилированию. Амины, образовавшиеся в этих реакциях, часто являются биологическиактивными веществами.

Исходный уровень:

1.Строение аминокислот, их классификация.

2. Уровни организации белковой молекулы, типы связей.

3. Классификация, физико-химические свойства белков.

4. Биологическая роль белков, ферментов в организме.

5. Классификация и номенклатура ферментов.

6. Активация зимогенов.

7. Этапы катабализма, их взаимоотношение с биоэнергетическими процессами.

8. Печень, почки, особенности строения и функции.

Вопросы для самоподготовки

1. Содержание белков в важнейших пищевых продуктах животного и растительного происхождения. Пищевые белки как источники аминокислот в организме.

2. Виды азотистого баланса. Азотистое равновесие.

3. Норма белка в питании, белковый минимум.

4. Факторы, определяющие биологическую ценность пищевых белков. Заменимые и незаменимые аминокислоты.

5. Роль соляной кислоты желудочного сока.

6. Заболевания, обусловленные отсутствием или избытком соляной кислоты в желудочном соке (ахлоргидрия, гипохлоргидрия, гиперхлоргидрия).

7. Протеолитические ферменты (протеиназы) желудочного, панкреатического и кишечного соков (пепсин, трипсин, химотрипсин), их функции, субстратная специфичность (избирательность гидролиза пептидных связей).

8. Проферменты протеиназ и механизмы их превращения в ферменты.

9. Роль экзопептидаз (карбоксипептидаза, аминопептидаза, дипептидаза) в образовании дипептидов и свободных аминокислот .

10. Продукты переваривания белков в желудочно-кишечном тракте и их всасывание.

11. Роль печени как диспетчера аминокислот в организме.

12. Гниение белков в кишечнике. Продукты гниения и пути их обезвреживания в печени.

13. Общие пути распада аминокислот в организме.

14. Декарбоксилирование аминокислот, образование биогенных аминов (гистамин, серотонин, -аминомасляная кислота, катехоламины) и их функции.

15. Дезаминирование аминокислот в тканях и его виды. Биологическое значение. Роль пиридоксина в дезаминировании.

16. Трансаминирование аминокислот. Биологическая роль. Роль витамина В6 в реакциях трансаминирования, механизм реакций. Специфичность аминотрансфераз.

Лабораторная работа

18.1. Обнаружение крови в желудочном соке

Особое значение в диагностике и установлении эффективности терапии болезней ЖКТ имеет исследование желудочного содержимого. При некоторых заболеваниях желудка (язва желудка, рак и др.), которые провоцируют повреждение местных сосудов, в желудочном соке может появиться кровь. Реакция на кровь в желудочном соке основана на окислении бензидина пероксидазой крови при участии пероксида водорода.

Ход работы

В пробирку внесите 1 мл исследуемого желудочного сока, 5 капель 0,2% спиртового раствора бензидина и 5 капель 1% раствора пероксида водорода. При наличии крови развивается синее окрашивание – образуется дифенохинондиимин (продукт окисления бензидина).

18.2. Реакция на молочную кислоту в желудочном содержимом

При отсутствии соляной кислоты, обладающей бактерицидными свойствами, в желудке могут развиться процессы брожения, сопровождающиеся накоплением короткоцепочечных (молочной, уксусной и масляной) кислот. Их обнаружение в желудочном содержимом свидетельствует о глубокой гипохлоргидрии или ахлоргидрии.

Ход работы

Для приготовления реактива на молочную кислоту к 1,5 мл 1% раствора фенола добавьте несколько капель 1% раствора хлорного железа и взболтайте. Реактив окрашивается в фиолетовый цвет. Разведите его водой до слабой окраски. В три пробирки налейте по 10 – 15 капель этого реактива, затем в 1-ую пробирку добавьте по каплям 1% раствор молочной кислоты, во 2-ю – исследуемый желудочный сок, в 3-ю - раствор соляной кислоты (контроль). В 1-ой пробирке наблюдается желто-зеленое окрашивание (окраска обусловлена образованием молочнокислого железа). Во 2-ой пробирке желто-зеленое окрашивание разовьется в случае наличия в желудочном содержимом молочной кислоты. В 3-ей пробирке раствор обесцвечивается.

18.3. Определение активности аланин-аминотрансферазы

Аланин-аминотрансфераза (АЛТ) (L-аланин: 2-оксоглутаратаминотранс-фераза) - присутствует в большинстве органов: печени, почках, скелетных мышцах, миокарде, поджелудочной железе. Максимальное количество данного фермента обнаруживается в тканях печени и почек. Его активность в сыворотке (плазме) крови здоровых людей значительно ниже, чем в тканях; при патологии (особенно при заболеваниях печени) активность АЛТ в сыворотке крови существенно повышается. В клетках этот энзим содержится в двух изоформах - цитозольной и митохондриальной, но содержание митохондриального фермента и вероятность его экскреции незначительны, поэтому основная доля плазматической активности АЛТ обусловлена действием цитозольного изоэнзима. Пиридоксальфосфат служит его коферментом. Аланинаминотрансфераза обратимо катализирует реакцию переноса амино- и кетогрупп между L-аланином и остатком -кетоглутаровой кислоты :

Химизм указанной реакции положен в основу большинства методов определения активности фермента в плазме / сыворотке крови. Для определения активности аланинаминотрансферазы существуют две группы методов: по конечной точке (колориметрические методы с использованием различных красителей) и кинетические (в основном, базирующиеся на методе Варбурга по считыванию восстановления/окисления НАДФН при 340 нм - в ультрафиолетовом спектре). Последние пользуются наибольшей популярностью в современной лаборатории. Метод основан на следующей реакции: пируват, образующийся в результате переаминирования аланина и α-кетоглутарата восстанавливают в лактат путем окисления НАДН+Н⁺, катализируемого НАД-зависимой лактатдегидрогеназой.

Пируват + НАДН+Н⁺ лактатдегидрогеназа Лактат + НАД⁺

Уменьшение концентрации НАД·Н при этой реакции ведет к снижению оптической плотности раствора при 340 нм в первые 2-3 минуты реакции и отражает активность АЛТ.

В норме активность фермента в сыворотки крови не должна превышать 45Ед/л.

Контроль выполнения лабораторной работы

1. Можно ли с помощью реакции (18.1) выявить наличие крови в моче?

2. С какой целью в реактив, полученный в работе 18.2, добавляют молочную и соляную кислоты?

3. Почему нормальный желудочный сок не дает положительную реакцию на лактат?

4. Для чего используется пероксид водорода в бензидиновой пробе?

5. Какой принцип лежит в основе определения активности АЛТ?

6. Какова в норме активность АЛТ плазмы.

4