Лабораторная работа

19.1. Количественное определение мочевины в крови

В норме 46 – 60% остаточного азота у здоровых людей приходится на долю мочевины, поэтому в настоящее время проводят определение именно этого компонента. В норме содержание мочевины в сыворотке крови составляет 2,5 – 8,3 ммоль/л. Увеличение ее уровня (гиперкарбамидемия) регистрируется при почечной патологии. При тяжелых заболеваниях печени, острых отравлениях лекарствами концентрация мочевины снижается.

Методы определения содержания мочевины подразделяют на две основные группы: ферментативные (уреазные) и неферментативные. Первые являются более точными и специфичными.

Принцип метода основан на способности уреазы гидролизовать мочевину с образованием аммиака, по уровню которого можно судить о концентрации мочевины в крови или других биологических жидкостях.

СО(NН₂)₂ + Н₂О уреаза NН₃ + СО₂

мочевина

Для установления содержания аммиака может быть применена реакция взаимодействия его с салицилатом натрия и гипохлоридом натрия в присутствии нитропруссида натрия, в результате которой образуется окрашенный продукт (зеленого цвета), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации мочевины в пробе.

Реактивы.

Реагент 1 – раствор уреазы (40 ед. акт/мл)

Реагент 2 – раствор салицилата натрия (1,4 моль/л) и нитро-пруссида натрия (0,2 моль/л)

Реагент 3 – раствор гипохлорита натрия (75 ммоль/л) и гидроокиси натрия (0,56 моль/л)

Стандарт - раствор мочевины известной концентрации

Ход определения

К 0,5 мл реагента № 1 добавьте 0,01 мл сыворотки крови (опытная проба), выдержите 5 минут при 37⁰С и прилейте по 2 мл реагентов 2 и 3. Параллельно приготовьте «стандартную пробу» и «бланк», для чего в первом случае вместо сыворотки возьмите 0,01 мл раствора мочевины, с известной концентрацией, а во втором аналогичный объем воды. Через 5 минут измерьте оптическую плотность растворов опытной и стандартной проб против бланка при 640 нМ. Расчет производят по формуле:

С_оп=Е_оп/Е_ст*С_ст

где – С_ст – концентрация стандартного раствора мочевины; Еоп – оптическая плотность опытного раствора; Ест – оптическая плотность стандартного раствора мочевины.

19.2. Качественная реакция на наличие фенилпировиноградной кислоты в моче

Очень тяжелым наследственным заболеванием, приводящим к глубоким психическим расстройствам, является фенилкетонурия (олигофрения фенилпирувика). Для ее диагностики используется способность енольной формы фенилпировиноградной кислоты, накапливающейся у больных в крови и выделяющейся в больших количествах с мочой, образовывать с ионами трехвалентного железа комплексные соединения, окрашенные в сине-зеленый цвет.

Установлено, что среди населения многих стран каждый ребенок из 15000-25000 рождается с дефицитом в ткани печени фермента, гидроксилирующего фенилаланин по 4 положению кольца - фенилаланин-4-гидроксилазы. Наиболее убедительным доказательством данного наследственного заболевания является установление повышенного уровня фенилаланина в крови (10-40мг/л) и наличие фенил ПВК в моче.

Ход работы

К 5 мл свежефильтрованной мочи добавьте 4 капли 5% раствора серной кислоты, после перемешивания к смеси прилейте 4 капли 10% раствора хлорного железа. При наличии в моче фенилпировиноградной кислоты через 30-60 секунд появляется сине-зеленая окраска, исчезающая через 5-10минут.

Контроль выполнения лабораторной работы

1. К какому классу относится фермент уреаза?

2. Как узнать концентрацию мочевины в стандарте?

3. Как можно доказать наличие блока фенилаланин-4-гидроксилазы?

Темы рефератов:

1. Подробная судьба аммиака, образовавшегося в клетке при дезаминировании (существует ли аммиак в тканях в виде газа?).

2. Молекулярная патология синтеза мочевины.

3. Основные механизмы развития наследственных болезней, связанных с нарушением обмена аминокислот.

4. ВЭЖХ как метод диагностики фенилкетонурии и алкаптонурии.

5. Гомоцистеин, его роль в организме. Диагностическое значение определения данного соединения при различных заболеваниях.