Исследование процесса агрегации форменных элементов крови

Агрегация форменных элементов крови (преимущественно эритроцитов) — один из важнейших патологических феноменов, возникающих в системе микроциркуляции. Это и обусловливает важность его количественного описания. Существует несколько способов оценки агрегации эритроцитов.

1. Метод, основанный на прижизненной биомикроскопии. Недостатками метода явля­ ются: субъективность в оценке степени агрегации, трудоемкость, необходимость микроско- пирования. Достоинством оценки агрегации эритроцитов путем прижизненной биомикро­ скопии является возможность с абсолютной достоверностью установить фактическое нали­ чие агрегации или дезагрегации.

2. Реоскопия — по существу является ротационной или капиллярной (капилляр с внутренним сечением в виде щели) реометрией с той лишь особенностью, что рабочие части прибора прозрачны. Это позволяет исследовать процесс агрегации и дезагрегации в

521

Рис. 10.20. Внешний вид агрегатограммы и определение индекса агрегации методом силлектометрии (объяснение в тексте).

зависимости от скорости деформации [Goldstone J. et al., 1970]. Использование реоскопии позволяет охарактеризовать агрегацию эритроцитов в отношении размеров и формы агре­гатов. Реоскопические исследования осуществляются со взвесями эритроцитов и с цельной кровью.

3. Метод оценки агрегации эритроцитов по скорости их оседания наиболее прост, но и наименее надежен. Между тем увеличенная СОЭ в подавляющем большинстве случаев сви­ детельствует о наличии феномена агрегации [Левтов В.А. и др., 1982].

4. Расчетный метод определения степени агрегации по L. Dintenfass (1962): его суть со­ стоит в вычислении отношения объема свободно осевших форменных элементов (при пол­ ном их осаждении) к объему форменных элементов, осажденных принудительно (центрифу­ гированием). К расчетным методам можно отнести также оценку феномена агрегации фор­ менных элементов крови по кривым течения или вязкости.

5. Фильтрационные методы оценки агрегации по существу аналогичны фильтрацион­ ным методикам определения деформируемости эритроцитов.

6. Фотометрический метод количественного определения агрегации эритроцитов. Суще­ ствует по меньшей мере два варианта его. Первый заключается в регистрации изменения оп­ тической плотности взвеси отмытых эритроцитов (100 000 ± 20 000 эритроцитов в 1 мкл) под влиянием вещества, вызывающего агрегацию, — индуктора агрегации. В качестве индуктора используется, например, краситель алциановый голубой, который, по мнению O'Brien (1971), уменьшает заряд эритроцитов и тем самым облегчает образование конгломератов клеток. Изменения оптической плотности исследуемой суспензии эритроцитов регистриру­ ют по времени графически. Критерием оценки степени агрегации служит скорость измене­ ния оптического сигнала. Недостатком метода является длительная подготовка проб, в про­ цессе которой нарушаются существующие в цельной крови межэритроцитарные взаимодей­ ствия. По-видимому, используя этот метод, можно достоверно судить лишь о способности суспензии эритроцитов в буферном растворе с рН 7,4 изменять оптическую плотность под влиянием конкретного индуктора агрегации.

Вторым вариантом фотометрического метода является так называемая силлектометрия. В основу метода положена графическая регистрация уменьшения интенсивности света, рас­сеиваемого кровью после прекращения перемешивания исследуемого образца. Заслуга теоретической разработки этого метода принадлежит отечественным исследователям, разра­ботки которых в этом направлении обобщены в монографии «Реология крови» [Левтов В.А. и др., 1982].

В качестве основного критерия для оценки агрегации эритроцитов используется индекс агрегации, рассчитываемый как единица, деленная на время, в течение которого амплитуда агрегатограммы уменьшается вдвое (рис. 10.20). При усилении процесса агрегации эритро­цитов скорость изменения оптического сигнала возрастает и коэффициент агрегации увели­чивается. Соответственно уменьшается площадь под агрегатограммой. При нанесении дан­ных агрегатометрии на логарифмическую бумагу получается прямая линия. Тангенс угла на-

522

клона этой прямой к оси времени также может быть использован в качестве показателя агре­гации эритроцитов.

Сопоставление данных, полученных силлектометрическим методом и методом витальной микроскопии, показывает качественное совпадение результатов.

Исследование суспензионной стабильности крови

Реологические параметры крови самым тесным образом связаны с ее суспензионными свойствами. Эти свойства крови характеризуются ее стабильностью, т.е. способностью фор­менных элементов находиться во взвешенном состоянии в плазме и не взаимодействовать между собой. Таким образом, понятие суспензионной стабильности крови шире, чем поня­тие агрегации, так как агрегационная устойчивость — лишь один из факторов, определяю­щих суспензионную стабильность. На практике обычно имеют дело с седиментационной ус­тойчивостью крови, под которой понимают способность форменных элементов оседать в стандартных условиях. Процесс оседания исследуют при помощи седиментометрии, вклю­чающей несколько методик.

Процесс седиментации форменных элементов крови весьма сложен. Его изучению по­священы детальные исследования [Чижевский А.А., 1980; Левтов В.А. и др., 1982].

В клинической практике целесообразно использовать простейшую седиментометричес-кую методику — построение зависимости СОЭ ~ f(t), называемую СОЭ-граммой. Это своего рода интегральный показатель суспензионной стабильности крови. Если кровь содержит эритроцитарные агрегаты, скорость оседания увеличивается. Увеличение скорости оседания приводит к ускоренному перемещению плазмы против сил гравитации. Ускорение этого своеобразного тока плазмы является вторичным по отношению к начальному увеличению скорости оседания за счет агрегации.

Скорость оседания форменных элементов и их агрегатов подчиняется закону Стокса:

где g — ускорение силы тяжести, р, — плотность дисперсной фазы, р₂ — плотность диспер­сионной среды, г — радиус частиц, ц — вязкость дисперсионной среды.

Очевидно, что V ~ г² и V ~ Ц. Таким образом, укрупнение частиц (или их агрегатов), т.е. увеличение г и соответствующее уменьшение вязкости плазмы (г|) ведут к закономерному увеличению скорости оседания. Характерно, что зависимость от радиуса частиц более силь­ная, так как радиус в уравнении возводится в квадрат.

СОЭ-грамму можно строить двумя способами: откладывая от оси ординат абсолютное значение высоты слоя плазмы или его процент по отношению к длине капилляра. При ис­пользовании стандартного капилляра длиной 0,1 м эти величины совпадают. Следует отме­тить, что для оценки суспензионной стабильности нежелательно добавление таких количеств антикоагулянтов, которые могут разбавлять кровь, как это происходит при определении СОЭ в классическом варианте. Для предупреждения свертывания крови предпочтительнее добавлять к ней лишь небольшое количество гепарина.

Изменения реакции седиментации во времени оказываются далеко не идентичными в норме и патологии. Вероятно, целесообразно рассматривать и сравнивать площади, описы­ваемые кривыми седиментации, рассчитывая суспензионную стабильность крови (ССК) по следующей формуле:

с

ССК = S = JC(t) dt,

о

где С — максимальный размах СОЭ-граммы.

Суспензионная стабильность крови, несомненно, должна оцениваться при характерис­тике ее реологических свойств. Необходимость такой оценки явствует и из чувствительности данного показателя, о которой можно судить по широкому использованию СОЭ в качестве неспецифического теста при лабораторной диагностике самых различных заболеваний. При­ложение показателей суспензионной стабильности крови к оценке ее текучести достаточно сложно, оно должно осуществляться в комплексном анализе с привлечением других показа­телей, отражающих реологические свойства, прежде всего с показателями агрегации фор­менных элементов.

523

Суспензионная стабильность крови и агрегация форменных элементов тесно связаны с величиной электрического заряда эритроцитов (потенциала). Заряд эритроцита определяется из соотношения G. Seaman (1971):

ЭФП-ti

где ЭФП — электрофоретическая подвижность эритроцитов, е₀ — электрическая постоян­ная, е — диэлектрическая проницаемость крови.

Электрофоретическую подвижность эритроцитов в свою очередь рассчитывают по фор­муле:

ЭФП = |,

где V — скорость движения эритроцитов в электромагнитном поле; Е — напряженность электрического поля.

Электрофоретическая подвижность измеряется при помощи специальных устройств, ос­новным узлом которых является прозрачная камера, позволяющая наблюдать движение эритроцитов в электромагнитном поле. Устройства отличаются друг от друга формой и раз­мерами камер. Наиболее широко распространены цилиндрическая [Abramson H., 1930] и ще­левая прямоугольная камеры [Харомоненко С.С, Ракитянская А.А, 1974]. Достоинства и не­достатки различных конструкций весьма подробно изложены в соответствующей литературе. Между тем результаты определения ЭФП в различных камерах мало отличаются друг от друга. Так, электрофоретическая подвижность эритроцитов, измеренная в цилиндрической камере, составляет 1,310~⁸ м²/Вс, а в камере С.С. Харамоненко — 1,32-1(Г⁸ м²/Вс.

Заряд эритроцита в среднем составляет (16—18)10~³ В. [Харамоненко С.С, Ракитян­ская А.А., 1974). Между тем существует точка зрения, что в действительности он несколько больше, а именно: (25,1±0,44)-10~³ В [Мищук И.И., 1979]. Последний результат получен при помощи метода подвижной границы, разработанного автором. Предлагаемая методика в от­личие от существующих не требует разведения крови. Это весьма ценно, так как, с одной стороны, метод исключает изменение дзета-потенциала за счет нарушения существующего в цельной крови гидропонного равновесия, а с другой — соответствует современной тенден­ции в медицинской лабораторной технике — стремлению к сокращению времени и объема пробоподготовки.

Кроме того, обычно применяемые агар-агаровые ключи часто выходят из строя вследст­вие ослизнения; в микрокамерах при электрофорезе, как правило, не удается избавиться от электроосмоса. Предлагаемый же метод подвижной границы лишен этих недостатков.

Заслуживает внимания метод определения ЭФП эритроцитов, предложенный Н.Д. Ки-таевой и соавт. (1976). Электрофорез клеток крови проводят в камере Горяева. При этом применяют плоские хлорсеребряные электроды, создающие весьма однородное электромаг­нитное поле с минимальным искривлением силовых линий в измерительном отделе камеры.

Если необходимо произвести более детальные исследования электрокинетического ком­понента суспензионной стабильности крови, целесообразно определять диэлектрическую проницаемость крови, а также ее электропроводность и тангенс угла потерь при помощи вы­сокочастотных мостов и другой аппаратуры.

Наряду с электрокинетическими свойствами эритроцитов следует определять их некото­рые простейшие геометрические параметры:

• средний объем единичного эритроцита;

• толщину отдельного эритроцита (ТОЭ);

• показатель сферичности (а) [Кассирский Н.А., Алексеев Г.А., 1970]. Норма 3,4—3,9, а < 3,4 — предрасположенность к сфероцитозу, а > 3,9 — предрасположенность к пла- ноцитозу;

• распределение эритроцитов по объему;

• построение кривой Прайс-Джонса.

Адгезивность форменных элементов — способность форменных элементов крови взаи­модействовать с сосудистой стенкой (осаждаться на ней) [Swank R., 1961]. A. Copley и соавт. (1960) предложили определять адгезивность форменных элементов по осаждению их на внутреннюю поверхность стеклянного капилляра из определенного объема крови, которая «прогоняется» по этому капилляру с известной скоростью или при известном давлении. В последнем случае измеряют время прохождения крови по данному капилляру, его длину, а затем скорость.

524

Толщину слоя осаждения (5) форменных элементов, характеризующую их адгезивные свойства, вычисляют по формуле:

s =

RA1

2Х '

где R — радиус капилляра; Д 1 — уменьшение длины основного индекса (пробы крови); X — длина слоя осаждения.

При пропускании проб крови через стандартный капилляр толщина слоя осаждения в норме составляет 4,7±0,3 мкм [Селезнев С.А. и др., 1976].

Таким образом, исследование реологических свойств крови включает комплекс мето­дик, требующих разнообразных, порой весьма трудоемких, вычислений. На схеме 10.2 пред­ставлены объем и алгоритмы комплексного реологического анализа.

Схема 10.2. КОМПЛЕКСНЫЙ РЕОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРОВИ

Забор крови

_f

Эритроцитная масса

Плазма

Цельная кровь

Гепаринизация Цитрат натрия

Геометрия эритроцитной

массы

Определение белкового спектра

Определение

относительной

вязкости плазмы

Агрегатометрия

Определение

гематокритного

числа

Реометрия цельной крови

Определение механических характеристик

эритроцитов

Определение статического предельного напряжения сдвига

Проба на «упаковку»