15.Вплив фізичних, хімічних та біологічних факторів на мікроорганізми. Стерилізація, методи та засоби стерилізації. Контроль ефективності стерилізації. Асептика. Антисептика.

Методи мікробної деконтамінації: стерилізація, дезінфекція, антисептика та асептика. Стерилізація(від лат. sterilis ~ безплідний, вільний від бактерій) - повне знищення вегетативних і спорових форм усіх мікроорганізмів на предметах, матеріалах, у живильних середовищах. Стерилізують інструменти, перев'язочний і шовний матеріал, операційну білизну, лікарські препарати. У мікробіологічних лабораторіях - живильні середовища, пробірки, піпетки, колби, чашки Петрі тощо. Оброблення інструментів: 1. прополіскують у проточній воді, 2. замочують у миючому розчині 15 хв, 3. миють у тому ж розчині 0,5-1 хв, 4. прополіскують проточною і дистильованою водою, 5. висушують у сухожаровій шафі при 80-85 °С до повного зникнення вологи. Пробірки, флакони, колби закривають ватними пробками. Пробірки загортають у папір по 25-30 штук, а чашки Петрі - по 4-5 штук або вміщують у стерилізаційні коробки (бікси). Пастерівські й градуйовані піпетки з широкого кінця затикають ватою, обгортають папером або вміщують у картонні чи металеві пенали по 10-15 штук. Живильні середовища в колбах, флаконах, пробірках закривають пробками. Види стерилізації: а) високою температурою; б) механічна (холодна); в) хімічними речовинами і газами. Стерилізація високою температурою. Ефективність характеризується показником D - часом, який необхідний при даній температурі, щоб отримати десятикратне зменшення популяції бактерій (на 90 %). Величина вимірюється, як правило, у хвилинах. Прожарювання в полум'ї пальника – бактерійні петлі, пінцети, предметні й покривні скельця. Кип'ятіння – 40 хв у спеціальних стерилізаторах – хірургічні інструменти, шприци, голки, гумові трубки. Для ? to кипіння й усунення жорсткості води – 1 % бікарбонатунатрію. Не забезпечує повної стерилізації(деякі види виживають/клостридії. Сухим жаром (сухожарова шафа) 160 °С, 120-150 хв/180 °С, 45-60 хв(після досягнення заданої температури). Стерилізують скляний посуд. Перевага – не пошкоджується скло, не відбувається корозії металевих інструментів. Використовують для стерилізації термостійких порошків, інших речовин. Недоліки – достатньо тривалий строк стерилізації, відбувається обвуглювання і загоряння ватних пробок, паперу, в який загорнутий посуд. Парою під тиском - повне знищення бактерій та спор. Досягається дією пари, to якої під тиском вища, ніж при кип'ятінні. Автоклавування. Більш ефективна, ніж дія сухого жару. Автоклави відрізняються: розміри, форма, розташування (вертикальні/горизонтальні), з ручним керуванням/напівавтоматичні/автоматичні. Конструктивно автоклав – двостінний міцний металевий котел циліндричної форми з кришкою(герметично закривається). Внутрішня частина – стерилізаційна камера(для матеріалу). Кран для виходу повітря і манометр (визначає робочий тиск пари в камері) із запобіжним клапаном (виходу надлишку пари, щоб не розірвало). Дистильовану воду в водопарову камеру заливають через лійку, стежать за її рівнем – водомірна трубка. Пара ? водопарова камера ? стерилізаційна камера(отвори в верхній частині). Сучасні автоклави мають манометри і автоматичні регулятори включення і відключення струму, тримаючи заданий тиск, задану to всередині автоклава. Правила роботи з автоклавом 1. Перед початком роботи – ретельно оглянути автоклав (контрольно-вимірювальну апаратуру, перевірити пружність резинової прокладки, кріплення кришки стерилізаційної камери). 2. Через лійку до рівня відмітки на водомірній трубці залити дистильовану воду і закрити кран. 3. Матеріал вміщують у стерилізаційну камеру, закривають герметично кришкою автоклава. Предмети не розташовують в автоклаві дуже тісно – між ним повинна проходити пара. 4. Відкривають кран, який з'єднує стерилізаційну камеру з оточуючим середовищем, і включають електричний нагрів. 5. Після початку процесу утворення пари, видаляють повітря із стерилізаційної камери – пару і конденсат відводять у спеціальну посудину з водою або в каналізацію. Чисту пару протягом 10 хв пропускають через камеру, потім закривають паровідвідний кран. 6. Доводять тиск пари до рівня, якого вимагає режим стерилізації. Для цього враховують співвідношення показників тиску манометра і температури кипіння води. 7. По завершенні С – відключають. Тиск поступово падає і зрівнюється з атмосферним. Тоді відкривають випускний кран і поступово випускають надлишок пари у посудину з водою. В автоклаві при 120 °С протягом 20 хв стерилізують прості живильні середовища (МПБ, МПА), ізотонічні розчини, білизну, перев'язочний матеріал, при 134 °С - заразні матеріали, відпрацьовані культури бактерій протягом 40 хв. Середовища з вуглеводами не витримують такої обробки, оскільки вони карамелізуються, у зв'язку з чим їх стерилізують текучою парою.

Текучою парою (100 °С) проводиться в автоклаві з незагвинченою кришкою. При нагріванні пара проникає між вкладеними об'єктами й стерилізує їх. Таким способом обробляють середовища з вуглеводами. Одноразова дія пари не вбиває спори, застосовують дробну стерилізацію—3 дні підряд по 30 хв. Спори, які не загинули, проростають до наступного дня у вегетативні клітини й гинуть при другій і третій обробці. Для речовин, які не витримують 100 °С (білкові рідини, вітаміни, деякі ліки) – тиндалізація – на водяній бані 58-60 °С протягом години 5-6 днів підряд. Пастеризація – одноразове прогрівання матеріалу до температури нижче 100 °С, знищення вегетативних форм мікроорганізмів. Спори живі. Мікроорганізми, що залишились, помітно ослабленими. Широко використовують у харчовій промисловості. Термічну обробку молока, пива, вина, різних соків при 70 °С протягом 30 хв або при 80 °С - 5-10 хв. Пастеризовані продукти зберігаються на холоді. Згортання (ущільнення) сироватки і яєчних середовищ з одночасною їх стерилізацією проводять у спеціальних згортувачах Коха з електричним підігрівом. Асептично приготовлені сироватки та яєчні середовища у нахиленому положенні прогрівають однократно при 80-90 °С одну годину. При підозрі на мікробну контамінацію їх прогрівають при тій же температурі три дні підряд. Механічні методи. Не руйнують субстрати. Рідкі середовища і рідини(містять білки, вітаміни, антибіотики, вуглеводи, леткі речовини тощо). Застосовують для очищення бактеріальних токсинів, бактеріофагів від мікроорганізмів. Менш надійний метод. Механічна (холодна) стерилізація – фільтрування через дрібнопористі антибактеріальні чи антивірусні фільтри. Їх створюють із спеціальних матеріалів, пронизаних порами, які мають різну форму та йдуть через фільтр звивисто. Фільтри можна виготовляти із позитивно зарядженого матеріалу, тоді бактерії, що несуть на поверхні негативний заряд ще й взаємодіють з ним електростатично, а не тільки механічно внаслідок різного діаметру бактерій і пор. Для перевірки якості фільтрів, використовують дрібні тест-мікроорганізми (Serratiamarcescensабо Pseudomonasaeruginosa). Фільтрат висівають на живильне середовище і витримують при оптимальній температурі протягом 5 днів. При відсутності росту тест-бактерій можна застосовувати фільтр для стерилізації. Мембранні або колоїдні фільтри, які виготовляють із нітроцелюлози, представляють собою диски діаметром до 3 5 мм. Фільтри Зейтца – пластини (диски або квадрати) товщиною 4-6 мм(суміші азбесту і целюлози). Недоліки: 1. можливе забруднення фільтратів сторонніми речовинами, які попадають у нього з фільтра (луги, солі лужних металів, волокна азбесту), 2. азбест внаслідок свого негативного заряду зв'язує деякі речовини з рідини, що фільтрується. Крім того, слід ретельно перевіряти фільтри перед роботою, щоб не використовувати ті, які мають механічну деформацію (тріщини, надломи тощо). Свічки Шамберлана – із каоліну й кварцового піску та надають форми циліндра, закритого з одного кінця. Величина пор позначається L1-L13. Фільтри L5-L13 – антибактеріальні. Свічки Беркефельда – з інфузорної землі (діатоміту або кізельгуру). За зовнішнім виглядом вони подібні до циліндрів, замкнутих з одного з кінців. Свічки маркують літерами V, N і W, що відповідає діаметру пор в межах відповідно 8-12, 5-7 і 3-4 мкм. Фільтри із скла „Пірекс" у вигляді двошарових дисків. Поділяють фільтри за розміром пор на три основних типи: С, М і Р. Розмір пор у них відповідно становить понад 1,7, від 1 до 1,7 і менше 1 мкм. Перед роботою фільтр закріпляють у спеціальному тримачі. Зокрема, азбестові пластинки вміщують між циліндричною й опорною частиною металевого корпусу апарата Зейтца. Обидві частини з'єднують гвинтами. Зібраний фільтр вставляють у гумовий корок колби Бунзена з боковим відростком. Повністю вмонтований фільтр загортають у папір і стерилізують в автоклаві. Рідину для фільтрування наливають у металевий циліндр, з'єднують боковий відросток колби з вакуумним насосом, щоб створити вакуум у колбі й прискорити фільтрування. Фільтрат у колбі буде стерильним. Хімічний спосіб – вироби з гумових і полімерних матеріалів – 6 % розчин перекису водню, в який занурюють вироби на 6 год при 18 °С і на 3 год при 50 °С. Можна застосувати розчин дексона з експозицією 45 хв при 18 °С. Після закінчення С вироби двічі прополіскують у стерильній дистильованій воді, кожного разу змінюючи її, та переносять корнцангом у стерильний бікс. Інструменти для ендоскопії й автоматичні піпетки можна також стерилізувати спиртом. Газовий метод (ГМ) – парами формальдегіду, хлороформу, ?-пропіолактону, окисом етилену, окисом пропілену, метилброміду, озоном – знезараження ендоскопічних інструментів, апаратів для штучного кровообігу, радіоелектронного обладнання, пластмасових виробів, кетгуту тощо. Ефективною зарекомендувала себе суміш окису етилену і бромистого метилу в співвідношенні 1:1,44. Для ГМ використовують спеціальні щільні камери, які герметично закриваються. Для кожного діючого фактора розроблено свої режими стерилізації. Після завершення процедури газова суміш викачується з камери і замінюється стерильним повітрям. Предметами, які було простерилізовано вказаним способом, рекомендується користуватись не раніше, ніж через 24 год – щоб видалився весь газ. Застосовують різні типи опромінення. У практиці використовуються для цього електрони, гамма-промені, ультрафіолетові промені, радіочастотне опромінення. Електронні прискорювачі дозволяють фокусувати електрони у вузький спрямований пучок високої потужності. Використовують для стерилізації в промислових масштабах хірургічного перев'язочного і шовного матеріалів на етапі виробництва. Недолік – низька проникність променів. До гамма-опромінення чутливі вегетативні та спорові форми різноманітних бактерій, грибів, дріжджів, віруси. Опромінення потужністю 2,5 Мрад – знезараження антибіотиків, вітамінів, гормонів, пластмасового одноразового устаткування (чашок Петрі, шприців), хірургічного перев'язочного та шовного матеріалів тощо. Ультрафіолетове опромінення – знешкодження бактерій в повітрі операційних, палат, боксів, мікробіологічних лабораторій тощо – бактерицидні лампи різної потужності – БУВ-15, БУВ-30 та ін. Мікроби можуть бути захищені численними органічними речовинами, пилом та іншими факторами. Вегетативні форми бактерій у 3-10 разів більш чутливі до УФО, ніж спори. Методи радіочастотного опромінення інтенсивно розробляють. Складність – небезпека для обслуговуючого персоналу (перешкоди систем зв'язку, різна часта опромінення). Для перевірки ефективності стерилізації, надійності роботи автоклавів застосовують хімічний та біологічний контроль. Відомі хімічні речовини з певною температурою плавлення: бензонафтол - 110 °С, антипірин -115 °С, сірка -119 °С, бензойна кислота - 120-122 °С, манноза і сечовина - 132-133 °С. Саме при таких температурах найчастіше здійснюють стерилізацію. Хімічні речовини вміщують у скляні трубки, додають невелику кількість анілінового барвника (сафранін, фуксин або метиленовий синій), запаюють і кладуть між об'єктами, що стерилізуються. Рівномірне забарвлення препарату в колір барвника в трубці свідчить про належну температуру в автоклаві, а отже й надійність стерилізації. Для біологічного контролю стерилізації в автоклав вміщують спеціальні біотести - смужки фільтрувального паперу, марлі тощо, на яких знаходяться спори бактерій з відомою термостійкістю, спори відомої чисельності та ін. Розкладаються в біксах, які підлягають стерилізації. Після завершення циклу в пробірки з смужками заливають живильне середовище та інкубують при оптимальній температурі. Відсутність проростання спор бактерій свідчить про ефективну стерилізацію.

16-17. Походження та еволюція мікроорганізмів. Сучасна класифікація прокаріотів. Основні таксони.

Бактерії поряд з археями були одними з перших живих організмів на Землі, з'явившись близько 3,9-3,5 млрд років тому. Еволюційні взаємини між цими групами ще до кінця не вивчені, є як мінімум три основні гіпотези: Н. Пейс передбачає наявність у них спільного предка протобактеріі, Заварзін вважає архей тупиковою гілкою еволюції еубактерій,за третьою гіпотезою археї - перші живі організми, від яких походять бактерії. Еукаріоти виникли в результаті симбіогенезу з бактеріальних клітин набагато пізніше: близько 1,9-1,3 млрд років тому. Для еволюції бактерій хаактерний яскраво виражений фізіо-біохімічний ухил: при відносній бідності життєвих форм і примітивній будові, вони освоїли практично всі відомі зараз біохімічні процеси. Найбільш поширеною є класифікація Бергі, в якій царство Procaryote ділиться на 4 розділи: 1) Gracilicutes (тонка стінка) 2) Firmicutes (товста стінка) 3) Tenericutes (позбавлені стінки) 4) Mendosicutes (є дефекти клітинної стінки) Відповідно до нового кодексу номенклатури бактерій запроваджено такі міжнародні класифікаційні категорії царства Procaryote: Розділ – Клас – Порядок – Родина – Рід – Вид. Основною номенклатурною одиницею є вид. Основні принципи систематики: геносистематика ( визначення подібності і відмінності ДНК бактерій) + числова таксономія (визначає спорідненість між мікроорганізмами за подібністю численних характеристик) + класичні методи (враховують морфологію, біохімію, фізіологію та інші властивості бактеріальної клітини) В основі сучасної класифікації мікроорганізмів лежить розташуваня їх за таксонами на основі схожості споріднених ознак. Характеристика виду:1) спільне походження 2) пристосованість до певного середовища життя 3) подібність обміну речовин та характеру міжвидових відношень 4) наявність подібного генетичного апарату, морфологічних та фізіологічних ознак Інфравидові варіанти ґрунтуються на відмінності за якимсь незначними спадковими властивостями: антигенними – сировар; морфологічними – морфовар; хімічними – хемовар; біохімічними або фізіологічними - бровар; патогенністю – патовар; відношенні до фагів – фаговар.

18. Матеріальні основи спадковості мікроорганізмів. Генотип і фенотип. Види мінливості. Не спадкова мінливість.

Генетика мікроорганізмів як вчення про спадковість і мінливості має характерні риси, що відповідають їхній будові й біології. Найбільш вивчена генетика бактерій, характерними рисами яких є малі розміри й більша швидкість розмноження бактеріальної клітини, що дозволяє простежити генетичні зміни протягом невеликого проміжку часу на великій кількості популяцій. Бактеріальна клітина має одинарний набір генів (немає алелей). Хромосома бактерій є полінуклеотидом (два полінуклеотидних ланцюжка ДНК) довжиною 1000 мкм. Вона суперспіралізована й замкнена в кільце: містить від 3000 до 5000 генів. Аналогічно хромосомі в цитоплазмі бактерій розташовуються ковалентно замкнені кільця ДНК, називані плазмідами (нехромосомні фактори спадковості). Маса плазмід значно менше маси хромосом. Хромосома й плазміда здатні до автономного самокопіювання – реплікації, тому їх називають репліконами. Властивості мікроорганізмів, як і будь-яких інших організмів, визначаються їхнім генотипом, тобто сукупністю генів даної особини. Термін «геном» відносно мікроорганізмів – майже синонім поняття «генотип». Фенотип являє собою результат взаємодії між генотипом і навколишнім середовищем, тобто прояв генотипу в конкретних умовах проживання. Фенотип мікроорганізмів хоча й залежить від навколишнього середовища, але контролюється генотипом, тому що характер і ступінь можливих для даної клітини фенотипових змін визначаються набором генів, кожний з яких представлений певною ділянкою молекули ДНК. В основі мінливості лежить або зміна реакції генотипу на фактори навколишнього середовища, або зміна самого генотипу в результаті мутації генів або їх рекомбінації. У зв'язку із цим фенотипову мінливість підрозділяють на спадкову й неспадкову. Неспадкоємна (середовищна, модифікаційна) мінливість обумовлена впливом в- та позаклітинних факторів на прояв генотипу. При усуненні фактора, що викликав модифікацію, дані зміни зникають. Спадкоємна (генотипова) мінливість, пов'язана з мутаціями, – мутаційна мінливість. Основу мутації становлять зміни послідовності нуклеотидів у ДНК, повна або часткова їхня втрата, тобто відбувається структурна перебудова генів, що проявляється фенотипово у вигляді зміненого ознаки. Спадкоємна мінливість, пов'язана з рекомбінаціями, називається рекомбінаційною мінливістю. Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову або модифікаційну та спадкову або генотипну.     Модифікаційна мінливість полягає у зміні різноманітних властивостей мікроорганізмів під впливом факторів навколишнього середовища, однак вона не зачіпає генетичний апарат клітини спадково не передається. Вона зумовлюється адаптаційними механізмами бактеріальної клітини, її здатністю призвичаюватись до умов довкілля за рахунок активації генів, які перебувають у “німому” стані.     Підлягають модифікаціям найрізноманітніші властивості бактерій. Досліджено зміни морфологічних ознак внаслідок старіння клітини, появу довгастих, зігнутих паличок вульгарного протею під впливом фенолу (рис. 5.5), зміну морфології холерного вібріона в результаті дії гліцерину. Під впливом пеніциліну, лізоциму, специфічних імунних сироваток грампозитивні та грамнегативні бактерії можуть втрачати свою клітинну стінку, перетворюючись у L-форми. Клітина при цьому втрачає свою типову морфологію, набуває кулястої форми, в ній можуть з’являтись дрібні зерна, вакуолі. Після припинення дії агента вони набувають звичного виду (рис. 5.6).     Отже, модифікаційні зміни нетривалі, характеризують ступінь пристосування бактерій до нових умов існування, вони є нормою реакції клітини, засвідчуючи потенційну здатність генотипу реагувати на змінені умови існування.     При генотипній мінливості мікроорганізмів різноманітні ознаки бактерій успадковуються та передаються нащадкам. Вона може розвиватись внаслідок мутацій та рекомбінацій.