66. Вірусологічні методи дослідження

методи вивчення біології вірусів та їх ідентифікації. У вірусології широко використовуються методи молекулярної біології, з допомогою яких вдалося встановити молекулярну структуру вірусних частинок, способи проникнення їх в клітку і особливості репродукції вірусів, первинної структури вірусних нуклеїнових кислот і білків. Розвиваються методи визначення послідовності складових елементів вірусних нуклеїнових кислот і амінокислот білка. З'являється можливість зв'язати функції нуклеїнових кислот і кодованих ними білків з послідовністю нуклеотидів і встановити причини внутрішньоклітинних процесів, що грають важливу роль в патогенезі вірусної інфекції.

Вірусологічні методи дослідження засновані також на імунологічних процесах (взаємодія антигену з антитілами), біологічні властивості вірусу (здатність до гемаглютинації, гемолізу, ферментативна активність), особливості взаємодії вірусу з клітиною-господарем (характер цитопатичної ефекту, освіта внутрішньоклітинних включень і т.д.).

В діагностиці вірусних інфекцій, при культивуванні, виділення та ідентифікації вірусів, а також при отриманні вакцинних препаратів широко застосовують метод культури тканин і клітин. Використовують первинні, вторинні, стабільні перевиваемие і диплоїдні клітинні культури. Первинні культури отримують при диспергирование тканини протеолітичними ферментами (трипсином, коллагеназой). Джерелом клітин можуть бути тканини і органи (частіше нирки) ембріонів людини і тварин. Суспензію клітин в живильному середовищі поміщають в так звані матраци, бутлі або чашки Петрі, де після прикріплення до поверхні судини клітини починають розмножуватися. Для зараження вірусами використовують зазвичай клітинний моношар. Живильну рідину зливають, вносять вірусну суспензію в певних розведеннях і після контакту з клітинами додають свіжу живильне середовище, зазвичай без сироватки

67. Всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою: 1) для виявлення антитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних антигенів-діагностикумів - для серологічної діагностики інфекційної хвороби; 2) для визначення невідомих антигенів (бактерій, грибів, вірусів) за відомими стандартними сироватками-антитілами - для серологічної ідентифікації збудників.Якщо в реакції антитіла з антигеном беруть участь низькодисперс-ні антигени (бактерії, клітини), спостерігається феномен, або реакція, аглютинації (РА); при взаємодії антитіл з високодисперсними антигенами (полісахариди, білки та їх комплекси) утворюються преципітати (флокуляти). У реакції преципітації (РП) завдяки полівалентній природі антигену й антитіла утворюються ґратчасті структури, будова яких залежить від кількісного співвідношення антигену й антитіла  

Коли до комплексу антиген — антитіло приєднується комплемент, відбувається  реакція зв'язування  комплементу (РЗК).

Взаємодія антитіла з антигеном може зумовлювати нейтралізацію токсину антитоксином (РН), активацію системи комплементу, реакцію негайної  гіперчутливості.

Антитіла, що належать до класів IgA і IgE, не мають властивості спричинювати РП, РА, РЗК-

У ряді випадків з'єднання антитіла з антигеном може бути неміцним; оборотність комплексу антиген—антитіло відбувається в результаті конформаційних змін молекули антитіла, при надлишку антигену або зменшенні спорідненості між антигеном і антитілом, а також під впливом зовнішніх факторів (температура, кислотність середовища та ін.).

Усі імунологічні реакції поділяють на моно- й полісистемні.РЕАКЦІЯ АГЛЮТИНАЦІЇ Аглютиніни — антитіла, що мають властивість спричиняти склеювання відповідних бактерій, еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів, клітин тканин, корпускулярних хімічних часточок з адсорбованими на них антигенами або антитілами з утворенням конгломератів (аглю-тинатів), видимих неозброєним оком.

Додавання відповідних імунних сироваток до зависі бактерій спричиняє їх аглютинацію  і випадання в осад у виглядіпластівців або зерен. В реакції аглютинації (моносистемній, прямій, двокомпонентній) беруть участь антитіло (аглютинін) і корпускулярний антиген (аглютиноген); вони взаємодіють у певних кількісних співвідношеннях і при наявності електроліту (0,85 % розчин натрію хлориду).

 РА бактерій з відповідними аглютинуючими сироватками характеризується специфічністю. Проте може траплятися групова аглютинація, тобто склеювання близьких, споріднених мікроорганізмів, хоч і в слабших розведеннях сироватки. Схематично це можна зобразити так: бактерія А містить аглютиногени а, Ь, с, бактерія В — b, c, d, бактерія С — с, d, є, а в сироватках крові імунізованих тварин утворюються  відповідні  їм  аглютиніни.

Для виявлення специфічних аглютинінів у сироватках крові тварин, імунізованих складним комплексом антигенів бактеріальної клітини, застосовують метод адсорбції аглютинінів (реакція виснаження   Кастеллані).

За допомогою методу адсорбції аглютинінів вивчають також антигенну структуру бактерій; крім того, його використовують для приготування специфічних аглютинуючих і лікувальних сироваток, вакцин і діагностикумів. Аглютинуючі сироватки, добуті методом адсорбції аглютинінів, називають монорецепторними. Вони дають змогу точніше визначати видову залежність низки збудників інфекційних  захворювань.

При імунізації тварин рухливими бактеріями, що містять джгутикові (Н) і соматичні (О) антигени, у них виробляються відповідно Н- і О-аглютиніни. Джгутикові аглютиніни спричиняють швидше склеювання бактерій у вигляді пухких пластівців, соматичні аглютиніни порівняно повільно утворюють конгломерати бактерій у вигляді дрібних зерен. На цій підставі Н-аглютинація називається крупнопластівцевою, а О-аглютинація — дрібнозернистою.

Бактерії, що містять Vi-антиген, слабко або зовсім не аглютинуються О-сироватками, але добре аглютинуються Vi-сироватками. Це доводить, що О- і Vi-антигени, так само як О- і Vi-антитіла, мають різну структуру.

 При здійсненні РА треба враховувати феномен затримки аглютинації. Це бувє як при занадто великих, так і при малих концентраціях імунної сироватки, взятої для РА. Цей феномен властивий усім реакціям імунітету і має враховуватись при лабораторній діагностиці інфекційних захворювань.

РА широко застосовують для серологічної діагностики черевного тифу, паратифів А і В (реакція Відаля), бруцельозу (реакція Райта), висипного тифу (реакція з рикетсіями Провачека), туляремії, лептоспірозу та інших захворювань, коли за допомогою відомих бактерій (діагностикумів) визначають у сироватці крові хворих відповідні аглютиніни.

РА використовують для ідентифікації виділених у хворих, людей і тварин мікроорганізмів із застосуванням заздалегідь відомих аглютинуючих сироваток.

Крім прямої аглютинації, у практиці діагностики інфекційних захворювань застосовують також реакцію непрямої гемаглютинації (РИГА), сутність якої полягає в тому, що антиген, який використовується для проведення РА з сироватками крові хворих, попередньо адсорбований на поверхні еритроцитів барана. Зокрема, РНГА застосовують при діагностиці черевного, висипного тифу і паратифів, туберкульозу, токсоплазмозу та ін. Для здійснення РНГА можна використати спеціальні еритроцитарні діагностикуми (завись формалізованих еритроцитів, «навантажених» антигенами або антитілами).

Стафілококів

1. Реакція преципітації відрізняється від аглютинації за характером антигенів: в реакції аглютинації вони корпускулярні, навіть цілі клітини, а в реакції преципітації – молекулярні, в розчинному стані. Антигенами можуть бути екстракти мікроорганізмів, тканин, органів, хімічні речовини.

Реакція преципітації (РП) — взаємодія розчинного антигену (пре-ципітиногену) й антитіла (преципітину) в присутності електроліту (0,85 %   розчин натрію хлориду).

РП має високу чутливість і специфічність. Вона дає змогу виявити антиген (преципітиноген) у розведенні 1 : 1 000 000 і 1 : 10 000 000. Як преципітиногени можуть бути використані білки тваринного, рослинного і бактеріального походження: кров, сироватка крові, екстракти з різних органів і тканин, харчових продуктів білкового походження (м'ясо, риба, молоко), фільтрати культур мікроорганізмів або тканин, уражених ними. Преципітиногени збудників сибірки, чуми, туляремії термостійкі. Деякі преципітиногени витримують нагрівання до температури  120—180 °С.

Відомо понад 20 модифікацій РП, які поділяють на кілька груп: РП у пробірках, капілярах, на предметних стеклах, фільтрувальному папері,  ацетатцелюлозній плівці, в гелі та ін.

РП використовують у діагностиці сибірки, туляремії, віспи та ін., а також при вивченні антигенної структури деяких груп бактерій. У судовій медицині за допомогою РП визначають видову належність плям крові, сперми; в санітарній експертизі виявляють домішки молока одного виду тварини у молоці іншого виду, добавляння штучного меду до натурального, фальсифікацію м'ясних, рибних, борошняних виробів і т. д. У біології РП застосовують для встановлення генетичних зв'язків близьких між собою видів тварин, рослин, мікроорганізмів.

Феномен преципітації полягає в тому, що антитіла (преципітини), зєднуючись із розчинними антигенами (преципітиногенами), зумовлюють утворення осаду (преципітату) або помутніння розчину. За титр реакції приймають найбільше розведення антигена, яке дає позитивний результат.

6Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР або PCR) 

— експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК в біологічному матеріалі (пробі). Крім простого збільшення числа копійДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад дляклонування генів, введення мутацій, виділення нових генів,секвенування, для створення і визначення генетично модіфікованих організмів, діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.

Хід реакції[]

Зазвичай при проведенні ПЛР виконується 20—35 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій (див малюнок 2):

1. Дволанцюгову ДНК-матрицю нагрівають до 94—96 °C (або до 98 °C, якщо використовується особливо термостабільна полімераза) на 0,5—10 хв., щоб ланцюги ДНК розділилися. Ця стадія називається денатурацією — руйнуються водневі зв'язки між двома ланцюгами. Іноді перед першим циклом проводять попереднє прогрівання реакційної суміші протягом 2—5 хв. для повної денатурації матриці і праймерів.

2. Коли ланцюги розійшлися, температуру знижують, щоби праймери могли зв'язатися з одноланцюговою матрицею. Ця стадія називається відпалом (англ. annealing). Температура відпалу залежить від праймерів і зазвичай вибирається на 4—5°С нижче за їх температуру плавлення. Час стадії — 0,5—2 хв.

3. ДНК-полімераза реплікує матричний ланцюжок, використовуючи праймер як затравку. Це так звана стадіяелонгації. Температура елонгації залежить від полімерази. Полімерази Taq і Pfu, що найчастіше використовуються, найактивніші за 72 °C. Час елонгації залежить як від типу ДНК-полімерази, так і від довжини фрагмента, який ампліфікують. Середня швидкість елонгації — 1000 пар основ за 1 хв. Після закінчення всіх циклів часто проводять додаткову стадію фінальної елонгації, щоб добудувати всі одноланцюжкові фрагменти. Ця стадія триває 10—15 хв.